Het bestuderen van celcyclusreguleerde genuitdrukking door twee complementaire celsynchronisatieprotocollen
June 6th, 2017
We rapporteren twee celsynchronisatieprotocollen die een context bieden voor het bestuderen van gebeurtenissen die verband houden met specifieke fasen van de celcyclus. We tonen aan dat deze aanpak nuttig is voor het analyseren van de regulering van specifieke genen in een ongeblokkeerde celcyclus of bij blootstelling aan agens die de celcyclus beïnvloeden.
Het algemene doel van dit protocol is om een context te bieden voor de analyse van genexpressie op een celcyclusspecifieke manier. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van kanker met betrekking tot celcyclusafhankelijke transcriptionele gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan maligne transformatie, evenals antikankerbehandeling. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het nauwkeurige celcyclusfase-specifieke genexpressiepatronen vaststelt, zowel in twee voorwaarden als na blootstelling aan chemotherapie.
U2OS-cellen worden gebruikt voor dit experiment en moeten 's avonds rond zeven uur in 100 millimeter schaaltjes worden gezaaid, zodat de volgende stappen tijdens werkuren kunnen worden uitgevoerd. Laat de cellen aan hechten door de schaaltjes 24 uur te incuberen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
De volgende dag onderzoeken de cellen om te bevestigen dat ze 50% confluentie hebben bereikt. Voor de Thymidine-blokkering, voeg 100 microliter van een vers bereide 200 millimolair thymidine stock toe aan elke 100 millimeter kweekschaal. Incubeer de cellen met Thymidine bij 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 gedurende 20 uur.
De volgende dag, rond drie uur, laat de cellen vrij van de Thymidine-blokkering door het Thymidine-bevattende groeimedium te verwijderen. Was de cellen twee keer met voorverwarmd 1X PBS.
En voeg vervolgens 10 milliliter compleet medium toe aan elk 100 millimeter schaaltje. Incubeer de cellen gedurende vijf uur bij 37 graden Celsius. Voeg voor mitotische celarrest nocodazole toe tot een uiteindelijke concentratie van 50 nanogram per milliliter.
Incubeer de cellen met nocodazole niet langer dan 10 tot 11 uur. De volgende ochtend, tussen zes en zeven uur, controleer de cellen onder de microscoop om te bevestigen dat ze inderdaad geblokkeerd zijn in G2-M, aangegeven door hun afgeronde uiterlijk.
Los de mitotische cellen los door elke schaal te schudden en voorzichtig het nocodazole-bevattende groeimedium met de losgelaten cellen uit elke 100 millimeter schaal te pipetten. Combineer de mitotische cellen uit alle schaaltjes in een 50 milliliter steriele buis. Centrifugeer 300 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.
Was de cellen twee keer door koude 1X PBS toe te voegen, gevolgd door centrifugatie. Nadat het PBS uit de tweede wassing is verwijderd, suspendeer de mitotische cellen in compleet kweekmedium. Bewaar twee milliliter voor RNA-extractie en twee milliliter voor FACS-analyse voor het nuluur tijdstip.
Herplant de resterende mitotische cellen voor de volgende tijdstippen in zes welplaatjes. Om dit proces te starten, zaai 0,25 keer 10 tot de zesde U2OS-cellen per wel in zes welplaatjes. Schrijf op de deksel van elke zes welplaat het experimentele voorwaarde voor elke wel.
Bijvoorbeeld, onbehandeld of behandeld met verschillende concentraties van het medicijn en tijdstippen. Laat de cellen aan hechten door de zes welplaatjes een nacht te incuberen. De volgende ochtend onderzoek de cellen om te bevestigen dat ze 50% confluentie hebben bereikt.
Verwijder het volledige medium uit de wel, en voeg twee milliliter voorverwarmd, FBS-vrij DMEM-Glutamine-medium per wel toe. Incubeer de cellen gedurende een extra 24 uur. Om de cellen te arresteren met hydroxyureum, verwijder het medium uit de wel en vervang het met vers bereid volledig medium dat vier micromolair hydroxyureum bevat.
Incubeer de cellen in hydroxyureum bevattend medium gedurende 24 uur. Voordat de cellen worden vrijgelaten van de hydroxyureum gemedieerde arrestatie, controleer de cellen om te bevestigen dat ze gearresteerd zijn. Verwijder het hydroxyureum bevattende medium uit de wel en spoel de wel twee keer met voorverwarmd 1X PBS.
Nadat het PBS uit de tweede wassing is verwijderd, voeg twee milliliter compleet medium per wel toe. Houd de platen in de incubator tot de monsterverzameling. Monsters uit beide synchronisatieprotocollen worden op dezelfde manier verzameld voor FACS-analyse en voor RNA-extractie.
Voor FACS-analyse, spoel elke wel met twee milliliter voorverwarmd 1X PBS, en voeg vervolgens 0,3 milliliter voorverwarmde Trypsin-EDTA-oplossing toe om de cellen los te maken. Na vijf minuten, inactiveer Trypsin-EDTA door een milliliter compleet medium toe te voegen. Verzamel elk monster in een aparte 15 milliliter buis.
Centrifugeer de cellen gedurende 300 keer G bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg, was met 1X PBS en centrifugeer opnieuw. Verwijder het PBS en bewaar de cellulaire pellet.
Om de cellen te fixeren, suspendeer elk cellulair pellet in een milliliter gekoeld 70% ethanol door voorzichtig te vortexen. Plaats de cellen gedurende ongeveer 15 minuten op ijs voorafgaand aan propidiumjodide kleuring en FACS-analyse. Voor RNA-extractie verwijder het medium en spoel elke wel met twee milliliter voorverwarmd 1X PBS.
Neem de plaat naar een veiligheidskast en voeg een milliliter geschikt RNA-isolatiereagens toe per wel. Pipet op en neer om de cellen te pipetten en te lyseren en draag vervolgens elk cellysaat over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.
Start de RNA-extractieprocedure door de microcentrifugebuizen met monsters in RNA-isolatiereagens uit de vriezer te halen en ze bij kamertemperatuur in een veiligheidskast voor chemicaliën te ontdooien. Voeg 400 microliter chloroform toe aan elk monster en schud krachtig zonder te vortexen totdat het volledig is gemengd. Incubeer de monsters gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.
Centrifugeer de buizen gedurende 15 minuten in een tafelmicrocentrifuge. Draag de waterige fase van elk monster over naar een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Voeg langzaam, druppel voor druppel, één volume van 100% ethanol toe aan de waterige fase tijdens het
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert twee celsynchronisatieprotocollen die zijn ontworpen om genexpressie tijdens specifieke fasen van de celcyclus te analyseren. De protocollen zijn bijzonder nuttig voor het bestuderen van transcriptionele gebeurtenissen gerelateerd aan kanker en de effecten van chemotherapie.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Kankeronderzoek
- Genexpressie
Achtergrond
- Het begrijpen van celcyclusregulatie is cruciaal voor kankeronderzoek.
- Genexpressiepatronen kunnen aanzienlijk variëren tijdens verschillende celcyclusfasen.
- Celsynchronisatietechnieken kunnen helpen deze fasen te isoleren voor studie.
- U2OS-cellen worden vaak gebruikt voor dergelijke experimenten.
Doel van het onderzoek
- Om protocollen te vestigen voor het analyseren van genexpressie op een celcyclusspecifieke manier.
- Om transcriptionele gebeurtenissen te onderzoeken die kunnen bijdragen aan maligne transformatie.
- Om de impact van chemotherapie op genexpressie tijdens de celcyclus te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Celsynchronisatieprotocollen werden ontwikkeld voor U2OS-cellen.
- Cellen werden gezaaid in 100 mm schotels en onder specifieke omstandigheden geïncubeerd.
- Genexpressie werd geanalyseerd in zowel onveranderde als behandelde omstandigheden.
- Experimenten waren ontworpen om tijdens standaard werkuren te worden uitgevoerd.
Belangrijkste resultaten
- De protocollen vestigden met succes celcyclusfase-specifieke genexpressiepatronen.
- Resultaten gaven aan dat er significante veranderingen in genexpressie waren na blootstelling aan chemotherapie.
- Bevindingen dragen bij aan het begrijpen van de moleculaire mechanismen van kanker.
- De methoden kunnen worden toegepast op verder onderzoek in kankerbehandeling.
Conclusies
- Celsynchronisatie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van genexpressie in kankeronderzoek.
- De vastgestelde protocollen kunnen het begrip van celcyclusdynamica verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze bevindingen om therapeutische strategieën te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate cell-cycle phase-specific gene expression analysis is critical for de-risking target validation in oncology drug discovery. This dual-protocol approach enables discrimination between direct drug effects and cell-cycle-mediated artifacts, improving predictive confidence in mechanistic studies. It supports early discovery workflows by providing synchronized models for probing transcriptional responses to genotoxic agents.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional hypotheses by isolating gene expression changes specific to G1/S or G2/M phases.
- Operational Value: Reduces false positives in target validation by distinguishing drug-induced transcriptional responses from cell-cycle artifacts.
- Predictive Value: Enhances confidence in target mechanisms by correlating expression profiles (e.g., E2F1, E2F7, p21-Cip1) with defined cell-cycle phases.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces synchronized cell populations suitable for consistent, reproducible transcriptional profiling across time points.
- Quantitative Output: Enables measurement of phase-specific gene expression changes via RNA extraction and downstream analysis.
- Scalability: Compatible with multi-well formats for dose-response or time-course studies in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to cancer models where cell-cycle dysregulation drives pathogenesis.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mechanistic insights with preclinical evaluation of genotoxic agents like mitomycin C.
- Risk Mitigation: Supports go/no-go decisions by clarifying whether observed gene expression changes are on-target or cell-cycle-mediated.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling phase-specific transcriptional analysis before lead optimization and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating cell-cycle-specific transcriptional events.
- Screening: Generates standardized, synchronized models for reliable compound-induced expression profiling.
- Analytics: Delivers quantitative, phase-resolved gene expression data essential for comparing treatment conditions.
- Translational Research: Connects early mechanistic findings to preclinical models by preserving cell-cycle context in drug response studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable synchronization platform applicable across multiple targets, pathways, and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in gene expression data.
- Operational Value: Delivers reproducible, standardized cell populations for consistent transcriptional readouts.
- Strategic Value: Improves decision-making efficiency by enabling clearer interpretation of drug effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by de-risking targets prone to cell-cycle confounding.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, synchronization techniques, and flow cytometry for cell-cycle validation.
- Dependent on access to flow cytometry and RNA isolation infrastructure for downstream analysis.
- Necessitates cross-team standardization of synchronization timing and sample collection protocols.
- Adaptation considerations include optimizing drug exposure windows relative to release from arrest.
- Practical limitations include potential stress responses from prolonged arrest, necessitating empirical optimization per cell line.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
11:07
Conclusion
9:02
Results: Thy-noc and HU Cell Synchronization Protocols Enable Analysis of Gene Expression During Specific Phases of the Cell Cycle
0:41
Thymidine- and Nocodazole-based (Thy-noc) Synchronization and Release
3:34
HU-based Synchronization and Release from G1/S Boundary
5:14
Collecting Samples for FACS Analysis and RNA Extraction
7:00
RNA Extraction for Gene Expression Analysis
