Manipulatie en analyse van celcyclusafhankelijke processen in ontluikende gist

We bestuderen hoe deelende cellen hun chromosomen trouw overdragen tijdens mitose, met de nadruk op de moleculaire machines en mechanismen die zorgen voor nauwkeurige chromosoomsegregatie. We synchroniseren cellen om moleculaire processen te bestuderen die veranderen met de celcyclus. Zonder deze methoden zouden belangrijke wijzigingen verborgen zijn in een niet-gesynchroniseerde celpopulatie.

In vergelijking met andere synchronisatiemethoden biedt alfa-factor arrestatie bij BAR1-mutanten een schonere, omkeerbare G1-arrestatie, waardoor we een volledige gistcultuur synchroon door de cyclus kunnen volgen. Ons werk onthult dynamische veranderingen in eiwitlokalisatie en activiteit gedurende de celcyclus, wat licht werpt op belangrijke mitotische processen, zoals chromosomensegregatie en spoelonderhoud. Om te beginnen inoculeer je gist in 25 milliliter YPAD-medium en breng je hem een nacht uit om een optische dichtheid van 600 nanometer tussen 0,5 en 2,0 te bereiken.

Verdunn de gistcellen tot een optische dichtheid van 600 nanometer van 0,5. Voeg alfa-factor toe aan de kweek om een uiteindelijke concentratie van één microgram per milliliter te bereiken. Tel na 2,5 tot 3,5 uur na toevoeging van de alfa-factor het percentage niet-gebudde shmooed cellen onder een microscoop om de celstilstand te beoordelen.

Daarna laat je de cultuur in een centrifuge draaien op 3.000 g gedurende drie tot vijf minuten bij 23 graden Celsius. Giet voorzichtig het supernatant eraf om de alfa-factor te verwijderen. Suspendeer de celpellet opnieuw in 25 milliliter YPAD met 1% dimethylsulfoxide om de cellen te wassen.

Breng de celpellet over in een verse buis en herhaal de washes nog twee keer voor in totaal drie washes om eventuele resterende alfa-factor te verwijderen. Voeg vervolgens YPAD toe aan de gewassen cellen om het uiteindelijke volume op 25 milliliter te brengen, en breng de suspensie over in een nieuwe fles voor verdere incubatie of gebruik. Verzamel het nul-minuut tijdpuntmonster direct na het vrijgeven en corrigeer het monster.

Beoordeel de synchronisatie van de celpopulatie 60 minuten na release onder een lichtmicroscoop. Voeg indien gewenst opnieuw alfa-factor toe 60 minuten na afgifte tot een uiteindelijke concentratie van één microgram per milliliter om de voortgang naar de volgende celcyclus te blokkeren. Blijf elke 15 minuten tijdspuntmonsters verzamelen tot 180 minuten of zo lang als nodig is.

Om de gistcellen te fixeren, centrifugeer je één milliliter cultuur gedurende één minuut op maximale snelheid. Aspireer het supernatant volledig. Daarna suspendeer je de pellet opnieuw in 500 microliter fixatieve oplossing en breng je het uit bij 23 graden Celsius gedurende twee tot vijftien minuten.

Na het centrifugeren van de vaste cellen aspireer je het supernatant en suspendeer je de pellet opnieuw in 500 microliter 0,1-molaire kaliumfosfaatbuffer bij pH 6,4. Voor beeldvorming centrifugeer je de vaste cellen op 23 graden Celsius gedurende één minuut op maximale snelheid. Zodra het supernatant is geaspireerd, suspendeer je de pellet opnieuw in 10 tot 100 microliter Triton-, DAPI- en sorbitoloplossing.

Pipetteer ongeveer 0,8 microliter van de gekleurde celsuspensie direct op het midden van een schone dekfolie. Gebruik een pipettip om de druppel voorzichtig te verspreiden over een cirkelvormig gebied van ongeveer één vierkante centimeter. Plaats de deklaag op een microscopie-dia.

Met een Kimwipe druk je voorzichtig rond de randen van de deklaag om het monster gelijkmatig te verdelen. Daarna sluit je de randen van het dekbeentje af met nagellak om het monster vast te zetten. Breng de voorbereide preparaat naar een microscoop met een 60-voudige vergroting, een 1,42 numerieke apertuur olie-immersieobjectief en een rood, groen, blauw en verrood laser- en filterset.

Richt de microscoop op de gistcellen die aan het dekmantel zijn vastgeplakt. Zodra het gefocust is, stel je de belichtingsinstellingen voor elk fluorescentiekanaal af om een signaal-ruisverhouding van minstens drie op één te bereiken. Pas de opname-instellingen aan om 14 tot 20 z-stack beelden te verzamelen, waarbij elke snee 0,2 micrometer uit elkaar is geplaatst, met een totale z-diepte van twee tot vier micrometer.

Bij microscopen uitgerust met post-processing modules kies je Deconvolution- en Quick Projection-opties voor elke z-stack afbeelding. Neem z-stacks van het monster en maak genoeg beelden om ongeveer 100 tot 200 gistcellen voor elke experimentele conditie of tijdstip vast te leggen. Voor analyse open je de geprojecteerde afbeeldingen in de ImageJ-software.

Pas de helderheid en het contrast van elk fluorescentiekanaal aan om de zichtbaarheid te verbeteren. Om de celcyclusprogressie te analyseren, telt u 100 cellen per tijdstip en classificeert u deze als bevattend één of twee kernen. Om het percentage cellen te berekenen dat Stu2-GFP punta tonen, standaardiseer je de groene kanaalhelderheidsinstellingen voor alle afbeeldingen.

Tel cellen die Stu2-GFP puncta laten zien die co-lokaliseren met Spc110-mCherry puncta als positief voor kinetochore lokalisatie. Gebruik vervolgens de vrijhandselectietool om de intensiteit van eiwitpuncta te kwantificeren om het interessegebied rond het signaal te schetsen. Voeg de selectie toe aan de Region of Interest Manager door op T te drukken of de optie te kiezen in het ROI Manager-menu.

Klik in de ROI Manager op Meten om de puntintensiteit te berekenen. Om veranderingen in de tijd te visualiseren, plot je de gemiddelde intensiteit met 95%-betrouwbaarheidsintervallen voor elk tijdspunt. Tel ongeveer 100 cellen per aandoening.

In G1-gearresteerde cellen lokaliseerde Stu2-GFP zich op een enkele spindelpool proximale punctum met extra verspreid signaal langs cytoplasmatische microtubuli. 60 minuten na de release werd Stu2-GFP gelokaliseerd als twee puncta naast gedupliceerde spilpolen gemarkeerd met Spc110-mCherry. Na 90 minuten, tijdens anafase, verscheen Stu2-GFP zowel nabij de spilpolen als langs microtubuli die de enkele as overspannen.

Na het mitotische vertrek, na 120 minuten, verscheen Stu2-GFP opnieuw op astrale microtubuli in het cytoplasma. Kwantificering toonde aan dat de Stu2-GFP-intensiteit nabij de spindelpolen toenam tijdens de vroege mitose, met een piek vóór anafase en daarna afnam. Het percentage binucleaire cellen bereikte een piek van ongeveer 90 minuten, wat wijst op gesynchroniseerde intrede in anafase.