Het combineren van de mitotische cel synchronisatie en hoge resolutie confocale microscopie om te bestuderen van de rol van multifunctionele celcyclus eiwitten tijdens de mitose
December 5th, 2017
Presenteren we een protocol voor de dubbele thymidine synchronisatie van HeLa cellen gevolgd door analyse met behulp van hoge resolutie confocale microscopie. Deze methode is de sleutel tot het verkrijgen van groot aantal cellen die zich synchroon van S-fase naar mitose, studies over mitotische rollen van multifunctionele eiwitten die ook interfase functies bezitten inschakelen.
Het algemene doel van deze procedure is om dubbele thymidine synchronisatie en hoog-resolutie confocale microscopie te gebruiken om de mitotische rollen van multifunctionele eiwitten te bestuderen die kritische interfasefuncties kunnen hebben. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van celbiologie, over hoe de normale functies van eiwitten die betrokken zijn bij celcyclus en mitose kunnen worden afgebakend. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat de cellen hun normale fysiologische gedrag kunnen behouden en dat deze methode ook heel eenvoudig uit te voeren is.
Het demonstreren van deze procedure zal Dr. Mohammed Amin zijn, een post-doc uit mijn laboratorium, die een expert is in het gebruik van deze methode. Voor vaste cel beeldvorming van mitotische cel progressie, begin door ongeveer twee keer 10 tot de vijfde HeLa cellen in elk putje van een zes-putjes plaat te zaaien, met daarin een 70% ethanol en UV gesteriliseerde dekglas en twee milliliters DMEM medium. Na 24 uur in een celcultuur incubator, blokkeer de cellen met twee milliliters vers verdunde thymidine en vers medium per putje, en plaats de plaat terug in de incubator voor nog eens 18 uur.
De volgende dag, was de cellen twee keer met twee milliliters PBS, en één keer met vers 37 graden Celsius medium. Plaats de cellen terug in de incubator gedurende negen uur om de cellen uit de blokkade te laten komen, gevolgd door het toevoegen van nog eens twee milliliters thymidine-supplementeerd medium per putje. Na de tweede blokkering incubatie, was de cellen twee keer met twee milliliters PBS, en één keer met twee milliliters vers 37 graden Celsius medium, en voeg 100 nanomolair van vers bereid siRNA toe aan de geschikte putjes.
Na negen tot 10 uur, zuig het supernatant af en fixeer de cellen op de dekglazen met vier procent paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Na het wassen met PBS, maak de vaste cellen doorlaatbaar met 0,5% detergent gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door twee vijf-minuten wasbeurten in PBS. Blokkeer de cellen met één procent BSA in PBS gedurende een uur bij kamertemperatuur.
Label vervolgens de cellen met 50 microliters van de primaire antilichamen van belang gedurende één uur bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, was de cellen drie keer in PBS, en label ze met 50 microliters van de geschikte secundaire antilichamen van belang. Na één uur bij kamertemperatuur, was de cellen twee keer in PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt, en label de cellen met DAPI gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.
Volg de DAPI kleuring met twee vijf-minuten wasbeurten in PBS en gebruik het geschikte montagemedium om de dekglazen op individuele heldere microscoopglazen te monteren. Vervolgens, met behulp van 60 of 100 X 1,4 numerieke apertuur plan apochromatische DIC olie-immersie objectieven gemonteerd op een omgekeerde hoge resolutie confocale microscoop uitgerust met een geschikte camera, verwerf beelden van de immunogeverfde eiwitten in Z stapels van 0,2 micrometer dikte. Voor levende cel beeldvorming van mitotische cel progressie, zaai ongeveer 0,5 tot één keer 10 tot de vijfde HeLa cellen stabiel expressie van mCherry H2B en GFP alfa-tubuline in 35-milliliter glazen bodem schalen met 1,5 milliliters DMEM medium.
Laat de cellen groeien in een celcultuur incubator gedurende 24 uur. Blokkeer vervolgens de cellen twee keer met thymidine zoals net gedemonstreerd, deze keer was de cellen twee keer met twee milliliters PBS en één keer met één milliliter voorverwarmd DMEM medium aan het einde van elke thymidine blokkade en behandel de cellen met siRNA na de eerste blokkade tijdens de eerste thymidine uitwassing. Laat de cellen groeien in vers voorverwarmd Leibovitz's medium, aangevuld met 10%FBS en 20 millimolar HEPES gedurende acht uur om de cellen uit de tweede blokkade te laten komen.
Plaats vervolgens de eerste plaat in de temperatuur-gecontroleerde kamer van een hoge resolutie confocale microscoop, en gebruik het 60 X objectief en helder veld beeldvorming om de cellen scherp te stellen. Wanneer de cellen zichtbaar zijn, pas handmatig de plaat positie aan naar het gewenste gebied en gebruik de beeldverwerving software om de laserkracht en belichting, beeldverwerving parameters, en experiment duur periode in te stellen. Selecteer de geschikte GFP en mCherry filters en verwerf elke 10 minuten pulserende doorgelaten licht en fluorescentie beelden gedurende maximaal 16 uur, om tijd-lapse beelden van het mitose proces te verkrijgen.
Negen uur na de vrijlating van de dubbele thymidine blokkade, verwerf de beelden op 12 een-micrometer gescheiden z-vlakken. Analyseer vervolgens de beelden door individuele mitotische cellen te volgen en gebruik de geschikte bronsoftware om een corresponderende film samen te stellen. Hoewel de meeste van de controle en Cdt1 siRNA cellen zich in de metafase bevinden op negen uur na de vrijlating van de dubbele thymidine blokkade, toont fixatie bij 10 uur dat de meeste van de Cdt1 siRNA-behandelde cellen nog steeds vastzitten in late prometafase, terwijl de controle cellen anafase binnengaan en hun chromosomen scheiden zoals verwacht.
Koude behandeling negen uur na de vrijlating van de dubbele thymidine blokkade vergemakkelijkt het behoud van stabiele kinetochoor microtubuli die relatief minder robuust zijn in Cdt1-gedepletiseerde cellen vergeleken met die in controle-gedepletiseerde cellen. DNA replicatie oorsprong licentie is niet verstoord in Cdt1-of controle-gedepletiseerde cellen tijdens de G2-M fase, aangezien deze cellen niet werden gevonden om de accumulatie van fosforaleerde gamma H2AX te induceren, een marker voor DNA schade, tijdens de volgende G2 fase. Cdt1 siRNA transfectie van asynchrone culturen induceert echter de accumulatie van fosfo gamma H2AX positieve foci mogelijk vanwege de DNA schade geïnduceerd door onjuiste DNA replicatie licentie.
Na breuk van de nucleaire envelop, gaan normale cellen de mitose binnen en ondergaan anafase begin om uit de mitose te stappen binnen ongeveer 30 tot 60 minuten. RNAi-gemedieerde knockdown van Hec1, een belangrijk kinetochoor eiwit dat
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft het gebruik van dubbele thymidine synchronisatie van HeLa-cellen, gevolgd door analyse met hoog-resolutie confocale microscopie. Deze benadering vergemakkelijkt de studie van mitotische rollen van multifunctionele eiwitten die ook interfase functies hebben.
Belangrijkste Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Celcyclus Regulatie
- Microscopie Technieken
Achtergrond
- Het begrijpen van de celcyclus is cruciaal voor inzichten in cellulaire functies.
- Multifunctionele eiwitten spelen belangrijke rollen tijdens zowel interfase als mitose.
- Hoog-resolutie beeldtechnieken zijn essentieel voor het observeren van cellulaire processen.
- Dubbele thymidine synchronisatie is een methode om gesynchroniseerde celpopulaties te verkrijgen.
Doel van Studie
- Om de mitotische rollen van eiwitten met interfase functies te onderzoeken.
- Om het begrip van de normale functies van eiwitten betrokken bij celcyclus progressie te verbeteren.
- Om een effectieve methode te demonstreren voor het bestuderen van celcyclus dynamica.
Gebruikte Methoden
- Zaaien van HeLa-cellen in een zes-well plaat.
- Blokkeren van cellen met thymidine om de celcyclus te synchroniseren.
- Gebruik van hoog-resolutie confocale microscopie voor beeldvorming.
- Handhaven van normaal fysiologisch gedrag van cellen tijdens de procedure.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle synchronisatie van HeLa-cellen van S fase tot mitose.
- Duidelijke visualisatie van mitotische processen met behulp van confocale microscopie.
- Inzichten in de rollen van multifunctionele eiwitten tijdens celdeling.
- Gedeemstreerde gemakkelijkheid van het uitvoeren van de synchronisatie methode.
Conclusies
- De dubbele thymidine synchronisatie methode is effectief voor het bestuderen van celcyclus dynamica.
- Deze benadering maakt het mogelijk om eiwitfuncties in mitose te onderzoeken.
- Hoog-resolutie beeldvorming levert waardevolle data op over cellulaire processen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to isolate mitotic functions of multifunctional proteins that also regulate interphase processes, reducing target validation ambiguity. By synchronizing cell populations and applying high-resolution confocal microscopy, researchers obtain quantitative, phase-specific data essential for mechanistic de-risking in early discovery. The approach supports predictive confidence in target selection by distinguishing mitotic from interphase roles, informing go/no-go decisions in oncology and cell cycle-targeted therapeutic pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by isolating mitotic roles of proteins with dual interphase/mitotic functions.
- Operational Value: Enables functional target validation through phase-specific perturbation and imaging.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying whether observed phenotypes stem from mitotic or interphase activity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces synchronized mitotic cell populations for consistent, reproducible compound or siRNA screening.
- Quantitative Output: Enables measurement of mitotic progression, chromosome alignment, and segregation defects as assay endpoints.
- Scalability: Compatible with high-resolution imaging platforms for multi-well format adaptation and large sample acquisition.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Mitotic defects observed in synchronized cells model chromosomal instability relevant to cancer phenotypes.
- Translational Continuity: Links discovery-phase target validation to preclinical models via conserved mitotic mechanisms.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insight to prioritize targets with reduced likelihood of on-target interphase toxicity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing mitotic-specific functional data before compound screening or phenotypic assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling conditional depletion and visualization of protein function in defined mitotic stages.
- Screening: Generates standardized, synchronized mitotic cells suitable for assay-dependent readouts like kinetochore-microtubule stability or anaphase timing.
- Analytics: Delivers quantitative imaging metrics (e.g., metaphase-to-anaphase transition, kinetochore fiber intensity) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects mitotic protein function to chromosomal stability phenotypes with relevance to preclinical cancer models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable synchronization and imaging workflow applicable across multiple targets in the cell cycle and mitosis space.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by separating mitotic from interphase protein functions.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible cell preparation and imaging compatible with confocal microscopy workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing phase-resolved functional data early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization by identifying proteins with selective mitotic roles and lower interphase liability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture synchronization, siRNA transfection, and immunofluorescence or live-cell imaging protocols.
- Depends on access to high-resolution confocal microscopy with Z-stack capability and appropriate laser/filter sets for GFP, mCherry, and DAPI.
- Necessitates standardization of thymidine block/release timing and fixation/permeabilization conditions across users and cell lines.
- Adaptation to non-HeLa systems may require optimization of synchronization efficiency and mitotic marker expression.
- Practical limitations include the need for careful toxin handling (paraformaldehyde, DAPI) and potential siRNA off-target effects requiring controls.
