Name: Ontwikkeling van Microfluidic apparaten te bestuderen van de rek mogelijkheid van plantencellen Tip groeiende in zeer kleine ruimtes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Leer hoe tipgroeiende plantencellen door nauwe ruimtes rekken met behulp van een PDMS-microfluidisch apparaat. Deze methode maakt hoogresolutiebeeldvorming van celdeformatie mogelijk voor plantenbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken H. Tsutsui en D. Kurihara voor ons te voorzien van transgene planten, met inbegrip van de T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato -lijn en de lijn van A. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover , respectievelijk. Dit werk werd ondersteund door het Instituut van transformatieve Bio-moleculen van Nagoya University en het Japan geavanceerde Plant Science netwerk. Financiële steun voor dit werk werd verstrekt door subsidies van de Japan Science and Technology Agency (ERATO project verlenen neen. JPMJER1004 voor T.H.), een Grant-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek op innovatieve gebieden (Nos. JP16H06465 en JP16H06464 voor T.H.), en Japan maatschappij voor de promotie van wetenschap (JSPS) Grants-in-Aid voor uitdagende verkennend onderzoek (subsidie no. 26600061 voor N.Y. en grant nos. 25650075 en 15 K 14542 voor aan).

1. fabricage van het PDMS Microdevice te onderzoeken groeiende Pollen buizen en mos Protonemata
Opmerking: We gebruikten een maskless fotolithografie instrument te bereiden PDMS mallen (wafers) van silicium. De details over de werking van het systeem worden weggelaten in dit manuscript. Een standaard fotolithografie techniek9 met behulp van een photomask kan ook worden gebruikt om het maken van de mallen van de PDMS beschreven in dit manuscript.
<ol><li>11 g van pre polymeer PDMS mengsel giet (elastomeer base: genezen van agent bij een verhouding van 10:1) in elke 4-inch mal.</li>
	<li>Ontgas de schimmel in stap 1.1 gedurende 20 min. in een vacuuemcel voorbereid.</li>
	<li>Na uitharding bij 65 ° C gedurende 90 min. in een niet-convectie oven, schil de PDMS laag uit de mal, en punch toegang gaten in de fluidic kanalen met biopsie stoten. Opmerking: Voor het stuifmeel buis-apparaat, de grootte van het gat moet worden aangepast voor de diameter van de stamper. Deze waarde zal daarom variëren per soort. In dit experiment sloeg wij een 1 mm gat voor de stamper inhammen en 1,5 mm gaten voor de vloeibare middellange reservoirs. Voor de Mos protonemata apparaat, werd een gat van 4 mm gebruikt voor het monster-reservoir.</li>
	<li>Bloot de PDMS laag en een glazen bodem schotel (3.5-5 cm in diameter) om de lucht van plasma voor 50 s.</li>
	<li>Druk op de PDMS laag in de glazen bodem schotel en warmte bij 65 ° C gedurende 30 minuten in een niet-convectie oven aan volledig afschermen van het microfluidic netwerk.</li>
</ol>2. de fabricage van het PDMS Microdevice voor Root haren
<ol><li>Herhaal stap 1.1-1.3 met behulp van de mallen voor te bereiden op twee PDMS lagen de wortel en de root haar microdevices. Opmerking: We gebruikt een 2 mm gat voor de vloeibare middellange stuwmeren in de wortel microdevice.</li>
	<li>Bloot zowel PDMS lagen lucht plasma voor 50 s.</li>
	<li>Monteer de twee lagen van het PDMS onder een stereomicroscoop met behulp van een op maat gemaakte desktop aligner. Opmerking: De microchannels op deze PDMS lagen moeten tegenover elkaar. Voor het monteren, door ervoor te zorgen dat de merken van de uitlijning op beide lagen opgewassen zijn.</li>
	<li>Warmte bij 65 ° C gedurende 30 minuten in een niet-convectie oven aan volledig afschermen van het microfluidic netwerk.</li>
	<li>Verwijder de cover slip uit de geconstrueerde microdevice en plaats het apparaat op een glazen bodem gerecht, dat is 5 cm in diameter.</li>
</ol>3. voorbereiding van de In Vitro cel kweekmedium stuifmeel buizen (Torenia fournieri)
<ol><li>Bereiden van gemodificeerde Nitsch medium zoals eerder beschreven15 en autoclaaf het medium bij 121 ° C gedurende 20 minuten. Opmerking: De samenstelling van de eveneens Nitsch de medium is NH4geen3 (80 mg/L), KNO3 (125 mg/L), Ca (3)2‧4H2O (500 mg/L), MgSO4‧7H2O (125 mg/L), KH2PO4 (125 mg/L ), MnSO4‧4H2O (3 mg/L), ZnSO4‧7H2O (0,5 mg/L), H3BO3 (10 mg/L), CuSO4‧5H2O (0,025 mg/L), Na2MoO4‧2H2O (0,025 mg/L), sacharose (50.000 mg/L) en caseïne (500 mg/L). Het bereid medium kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor 4 maanden ten minste.</li>
	<li>Bereiden van 26% (m/v) polyethyleenglycol met behulp van gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water en filtreer de oplossing met een 0,3 µm porie filter. Opmerking: Het bereid medium kan worden achtergelaten bij 4 ° C gedurende 1 maand.</li>
	<li>Meng de reagentia bereid in stap 3.1 en 3.2 in een verhouding van 1:1 (v/v). Opmerking: Dit medium moet voorbereid zijn zoet elk gebruik.</li>
</ol>4. voorbereiding van de In Vitro cel kweekmedium Root haren (Arabidopsis thaliana)
<ol><li>Bereid een oplossing van sacharose voor 0.215% (m/v) Murashige & Skoog Medium, 0.05% (m/v) MES, 1% (m/v), en 1% (m/v) agar in gedeïoniseerd water. Autoclaaf de oplossing bij 121 ° C gedurende 20 minuten.</li>
</ol>5. voorbereiding van de In Vitro cel kweekmedium Moss Protonemata (Physcomitrella patenen)
<ol><li>Vooraf Incubeer de Mos-protonemata in BCDAT middellange16 in een petrischaal. Opmerking: De samenstelling van BCDAT medium is 1 mM MgSO4, 10 mM KNO3, 45 µM FeSO4, 1,8 mM KH2PO4 (pH aangepast aan 6.5 met KOH), spoorelement oplossing (0,22 µM CuSO4, 0,19 µM ZnSO4, 10 µM H3BO 30.1 µM nb2MoO4, 2 µM MnCl2, 0,23 µM CoCl2, en 0,17 µM KI), 1 mM CaCl2en 5 mM diammoniumfosfaat (+)-tartraat.</li>
	<li>Cultuur het mos in het medium van de BCDATG in de microdevice. Opmerking: Het BCDATG medium is BCDAT medium met 0,5% (w/v) glucose. Het bereid medium kan worden achtergelaten bij 4 ° C gedurende 1 maand.</li>
</ol>6. in Vitro Culturing van T. fournieri Pollen buizen in de Microdevice
<ol><li>Plaats de stuifmeel buis microdevice in een vacuuemcel en ontgas voor 20 min.</li>
	<li>Verwijder de microdevice uit de Vacuuemcel en het groeimedium kennismaken met de inlaat van de stamper met behulp van een micropipet met een zeer fijne tip. Vul de resterende putten om hun toppen met hetzelfde medium. Wacht een paar minuten totdat alle de microchannels zijn gevuld met het medium door het vacuüm gecreëerd binnenin de microchannels.</li>
	<li>Plaats enkele natte papieren handdoek in de schotel onder glas om de luchtvochtigheid in de schotel.</li>
	<li>Overbrengen van het stuifmeel korrels van een wild-type T. fournieri 'blauwe en witte' bloem haar stigma met behulp van een naald dissectie. Opmerking: We leidee dit experiment met een transgene T. fournieri 'Kroon violet' bloem (de RPS5Ap::H2B-tdTomato lijn17), met stuifmeel buizen met fluorescently geëtiketteerde zaadcellen en vegetatief kernen.</li>
	<li>Knip de zaadvast stijl (1 cm lang) met behulp van een mes.</li>
	<li>Plaats de gesneden stijl in de inlaat van het apparaat zoals afgebeeld in Figuur 2.</li>
	<li>Zet een deksel op de schotel en verzegel het met tape.</li>
	<li>Plaats het apparaat in een incubator bij 28 ° C gedurende 5-6 uur in de duisternis.</li>
</ol>7. in Vitro Culturing van A. thaliana Root haren in de Microdevice
Opmerking: Stappen 7.1-7,9 (behalve 7.3 en 7.5) moeten worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap.
<ol><li>Steriliseren van zaden van A. thaliana Columbia (Col-0) en de transgene UBQ10pro::H2B-mClover (met de fluorescerende nucleaire marker) door inweken hen in steriele vloeistof (5% (v/v) huishoudelijk bleekwater en 0,02% (v/v) Triton X-100) gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Spoel de gesteriliseerde zaden met gesteriliseerde met autoclaaf water.</li>
	<li>Slaan de gespoeld zaden in water voor 2 dagen bij 4 ° C in het donker.</li>
	<li>De microdevice onder UV-licht 's nachts steriliseren.</li>
	<li>Plaats de microdevice in een vacuuemcel en ontgas voor 20 min.</li>
	<li>Het groeimedium kennismaken met de putten in het apparaat met behulp van een micropipet. Wacht enkele minuten totdat het vacuüm alle van de microchannels met het medium vult.</li>
	<li>Plaats de gesteriliseerde met autoclaaf natte papieren handdoek in de schotel onder glas om de luchtvochtigheid in de schotel.</li>
	<li>Pipetteer een gesteriliseerde zaad in de inlaat van het apparaat.</li>
	<li>Zet een deksel op de schotel en verzegel het met tape.</li>
	<li>Plaats het apparaat verticaal in een incubator bij 22 ° C onder voortdurende wit licht.</li>
	<li>Controleer root haargroei na 4-10 dagen incubatie. Zowel de lichte veld en de fluorescerende beelden met behulp van een omgekeerde Microscoop verkrijgen.</li>
</ol>8. in Vitro Culturing van P. patens (moss) Protonemata in het Microfluidic-apparaat
Opmerking: Stappen 8.2-8.6 (met uitzondering van 8.3) moeten worden uitgevoerd in een laminaire flow-kap.
<ol><li>Preculture P. patens stam Gransden 200418 op de drager van het BCDAT bedekt met cellofaan in een petrischaal gedurende één week onder continue wit licht bij 25 ° C.</li>
	<li>Het steriliseren van de microdevice onder UV-licht 's nachts in een laminaire flow-kap.</li>
	<li>Plaats de microdevice in een vacuuemcel en ontgas voor 20 min.</li>
	<li>Het groeimedium kennismaken met de putjes met behulp van een micropipet. Wacht enkele minuten totdat het vacuüm alle van de microchannels met het medium vult.</li>
	<li>Voeg gesteriliseerde met autoclaaf water in de schotel rondom de microdevice om de luchtvochtigheid in de schotel.</li>
	<li>Een klein stukje mos protonemata weefsel overbrengen in de inlaat van de microdevice en de cultuur van het weefsel in een incubator bij 25 ° C onder voortdurende wit licht.</li>
	<li>Controleer de Mos protonemata groei na 2-3 weken incubatietijd. Verkrijgen helder veld beelden met behulp van een microscoop.</li>
</ol>9. time-lapse beeldvorming van T. fournieri stuifmeel buis groei
<ol><li>Plaats de microdevice op een omgekeerde fluorescentie Microscoop uitgerust met afbeelding overname hardware (bijv., een CCD-camera) en software. Het vinden van de locaties van de microgap. Opmerking: Voor de afbeelding acquisitie software gebruikten we een commercieel beschikbaar product (Tabel van materialen). Opensource microscopie software zoals µManager is ook beschikbaar online (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). Het is raadzaam een Microscoop condensor installeren op de Microscoop te verkrijgen van resolutiebeelden met een hogere.</li>
	<li>Helder veld fotograferen elke 10 s met behulp van de Microscoop afbeelding acquisitie software.</li>
	<li>Om te zien hoe de fluorescently geëtiketteerde zaadcellen en vegetatief kern in de stuifmeel buis van de RPS5Ap::H2B-tdTomato -lijn, het model met 561 nm laser bestralen en een bandfilter optische filter gebruiken (578/105 nm). Opmerking: Hoewel de time-lapse beelden van stuifmeel buis groei vaak gevangen werden, imaging niet lijken te groei beïnvloeden. Het is echter altijd raadzaam om te minimaliseren van de laser intensiteit, belichtingstijd of time-lapse-intervallen om de fototoxiciteit en photobleaching van de fluorophore te minimaliseren.</li>
	<li>Aanpassen van de helderheid en het contrast van de beelden en een video bestand met behulp van ImageJ software (https://imagej.nih.gov/ij/) te bereiden.</li>
</ol>

<ol><li>Higashiyama, T., Takeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanism+and+Key+Molecules+Involved+in+Pollen+Tube+Guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance.</a> Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).</li>
<li>Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVogler%2C+H+%22Pollen+Tip+Growth%22">Pollen Tip Growth</a>. Obermeyer, G., Feijó, J. , Springer. 65-85 (2017).</li>
<li>Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jxb/article/50/334/565/525736">Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants.</a> J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).</li>
<li>Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01282125">The turgor pressure of growing lily pollen tubes.</a> Protoplasma. 198, 1-8 (1997).</li>
<li>Vogler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pollen+tube%3A+a+soft+shell+with+a+hard+core%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The pollen tube: a soft shell with a hard core.</a> Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).</li>
<li>Shamsudhin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallelized+pollen+tube+guidance+and+mechanical+measurements+on+a+Lab-on-a-Chip+platform%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform.</a> PloS one. 11 (12), e0168138(2016).</li>
<li>Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feijó, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pollen+tube+journey+in+the+pistil+and+imaging+the+in+vivo+process+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy.</a> J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).</li>
<li>Metzner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+MRI+and+X-ray+CT+technologies+for+3D+imaging+of+root+systems+in+soil%3A+Potential+and+challenges+for+root+trait+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification.</a> Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+Fluorescence+Imaging+of+Arabidopsis+Root+Growth+with+Rapid+Manipulation+of+The+Root+Environment+Using+the+RootChip%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).</li>
<li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.3604788">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703(2011).</li>
<li>Bascom, C. S., Wu, S. -Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27406170">Long-Term Growth of Moss.</a> in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).</li>
<li>Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+in+vitro+of+the+pollen+tube+to+the+naked+embryo+sac+of+Torenia+fournieri%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri.</a> Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).</li>
<li>Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagged+mutagenesis+and+gene-trap+in+the+moss%2C+Physcomitrella+patens+by+shuttle+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis.</a> DNA Res. 7, 9-17 (2000).</li>
<li>Maruyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Control+by+Each+Female+Gamete+Prevents+the+Attraction+of+Multiple+Pollen+Tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes.</a> Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).</li>
<li>Rensing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Physcomitrella+genome+reveals+evolutionary+insights+into+the+conquest+of+land+by+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants.</a> Science. 319, 64-69 (2008).</li>
<li>Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capability+of+tip-growing+plant+cells+to+penetrate+into+extremely+narrow+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps.</a> Sci. Rep. 7 (1), 1403(2017).</li>
<li>Dolan, L., et al. <a target="_blank" href="http://dev.biologists.org/content/120/9/2465">Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis.</a> Development. 120, 2465-2474 (1994).</li>
<li>Denais, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+envelope+rupture+and+repair+during+cancer+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration.</a> Science. 352 (6283), 353-358 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Verschillende kritische stappen in het protocol moeten worden gevolgd om juist te verkrijgen van de resultaten van bovenstaande. Eerst, de PDMS laag en glazen bodem schotel oppervlakken moeten beide worden behandeld met plasma voor een voldoende hoeveelheid tijd voordat hechting. Anders kan de PDMS laag lokaal losmaken van het glasoppervlak terwijl tip groeiende cellen zijn het overschrijden van de microgaps. Een andere cruciale stap in het haar van de wortel en moss protonemata-protocol is de sterilisatie van de microde...

Nadat stuifmeel korrels op een stigma ontkiemen, produceert elke graan een enkele stuifmeel buis dat zaadcellen de eicel en de centrale cel in de zaadknop voor double bevruchting draagt. Stuifmeel buizen elongate door middel van de stijl en uiteindelijk het bereiken van de zaadknop door het aftasten van meerdere begeleiding signalen langs hun manier1. Tijdens de rek tegenkomen stuifmeel buizen een aantal fysieke belemmeringen; de verzendende track is gevuld met cellen, en pollen buizen moet invoeren de minieme micropylar opening van de zaadknop te bereiken hun doel (figuur 1A)2. Stuifmeel buisjes moeten daarom de mogelijkheid om te penetreren fysieke obstakels, terwijl het gedogen van de drukspanning uit hun omgeving. Root haren zijn een ander soort tip groeiende plant cel die moet bestand zijn tegen fysieke obstakels in de omgeving, in de vorm van verpakte gronddeeltjes (figuur 1B).
Diverse mechanische eigenschappen van het stuifmeel buis zijn bestudeerd, met inbegrip van turgor druk en stijfheid van de apicale regio van de cel, die kan worden gemeten met behulp van de beginnende Plasmolyse methode3,4 en cellulaire kracht microscopie (CFM) 5 , 6, respectievelijk. Echter, deze methoden alleen niet onthullen of stuifmeel buizen staat grondvlak via fysieke barrières langs hun groei paden zijn. Een alternatieve techniek waarmee stuifmeel buis rek gecontroleerde in vivo is twee foton microscopie7. Met deze methode, het is echter moeilijk te observeren de morfologische veranderingen in individuele stuifmeel buizen diep in het weefsel van de zaadknop. Bovendien kan root haargroei in de bodem worden gevisualiseerd met behulp van X-ray berekend tomografie (CT) en magnetic resonance imaging (MRI)8, zij het met een lage resolutie. Hier presenteren we een methode die kan worden gebruikt voor het verwerven van resolutieafbeeldingen van deformatieproces in van een cel op een conventionele Microscoop.
Het algemene doel van de hier beschreven methode is om te visualiseren de rek mogelijkheid van tip-groeiende plantencellen, met inbegrip van stuifmeel buizen, root haren, en mos protonemata, in uiterst kleine ruimtes. Zoals de microdevices van de poly-dimethylsiloxane (PDMS) gepresenteerd in dit manuscript optisch transparant zijn en door de lucht permeabele, we kunnen cultuur van levende cellen binnen in het apparaat en observeren van het gedrag van hun groei onder een microscoop. Het is ook mogelijk te maken van micro ~ nanometer schaal ruimten door de zachte lithografie techniek9 met het gebruik van mallen. Deze functies laten te bestuderen van de rek mogelijkheid van plantencellen tip-groeien in een fysiek afgesloten omgeving.
In dit werk, we gebouwd 1 µm breed lacunes (4 µm in hoogte) in microfluidic apparaten en de mogelijkheid van stuifmeel buizen te dringen deze kunstmatige obstakels die veel kleiner dan de diameter van de cilindrische stuifmeel buis (ongeveer 8 µm zijn) onderzocht. Dit experimenteel platform ons in staat stelt om te visualiseren de stuifmeel buis van reactie op microgaps en vastleggen van time-lapse beelden van de reactie, die van de cel vervorming proces volgen. Ook ontwikkelden we de microdevices die kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de mogelijkheden van de penetratie van root haren en mos protonemata. Verschillende microdevices hebben gemeld tot nu toe waarmee de visualisatie van plant10,11,12,13 en moss protonemata14 wortelgroei met hoge resolutie. In onze apparaat, een reeks van root haar groei kanalen loodrecht op een root groei kamer zijn aangesloten en individuele root haren (ongeveer 7 µm in diameter) worden geleid tot fluidic kanalen met een 1 µm breed opening. Wij ook gekweekt moss protonemata (ongeveer 20 µm in diameter) in een microdevice met microgaps te onderzoeken hun reacties op deze fysieke barrières. De voorgestelde microfluidic gebaseerde aanpak laat ons toe om verkennen van de mogelijkheid van verschillende tip groeiende plantencellen om te rekken door zeer kleine ruimtes, die door een andere beschikbare methode kunnen niet worden onderzocht.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning Co.</td><td>Sylgard184</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog Medium</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>392-00591</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Dojindo</td><td>345-01625</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>50 mm glass-bottom dish</td><td>Matsunami Glass</td><td>D210402</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass-bottom dish</td><td>Iwaki&nbsp;</td><td>3971-035</td><td></td></tr><tr><td>Surgical blade</td><td>Feather</td><td>No.11</td><td></td></tr><tr><td>biopsy punches</td><td>Harris</td><td></td><td>Uni-Core</td></tr><tr><td>Gel loading tips</td><td>Bio-Bik</td><td>124-R-204</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric</td><td></td><td>Geen catalogusnummer is beschikbaar voor deze aangepaste microscoop</td></tr><tr><td>MetaMorph imaging software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van microfluidic apparaten te bestuderen van de rek mogelijkheid van plantencellen tip groeiende in zeer kleine ruimtes

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip groeiende plantencellen moeten overwinnen van een aantal fysieke belemmeringen; onderzoekers ontbreekt echter de methodologie om te visualiseren van cellulaire gedrag in dergelijke beperkende voorwaarden. Om dit probleem te verhelpen, hebben we groei kamers voor tip groeiende plantencellen die een aantal smalle, micro-verzonnen lacunes (~ 1 µm bevatten) in een poly-dimethylsiloxane (PDMS) substraat. Deze transparante materiaal zorgt voor de gebruiker te volgen uiteinde rek processen in afzonderlijke cellen tijdens microgap penetratie door time-lapse imaging. Met behulp van deze experimenteel platform, waargenomen wij morfologische veranderingen in stuifmeel buizen als ze de microgap doorgedrongen. We veroverde de dynamische veranderingen in de vorm van een fluorescently geëtiketteerde vegetatieve kern en zaadcellen in een stuifmeel buis tijdens dit proces. Bovendien, we toonden de mogelijkheden van de root haren en mos protonemata te dringen de 1 µm-kloof. Dit platform in vitro kan worden gebruikt om te bestuderen hoe individuele cellen reageren op fysiek beperkte ruimten en kan inzicht verwerven in de mechanismen van de tip-groei.

Als aangegeven in Figuur 1, tegenkomen plantencellen tip groeiende een aantal fysieke barrières langs hun groei paden in vivo. De microfluidic in vitro cel cultuur platforms gepresenteerd in deze studie ingeschakeld het onderzoek naar de tip-groeiende proces in drie soorten plantencellen (stuifmeel buizen, root haren en mos protonemata) via 1 µm kunstmatige lacunes (Figuur 3, Figuur 4</stron...

Beschrijven we een methode voor het onderzoeken van de mogelijkheid van tip-groeiende plantencellen, met inbegrip van stuifmeel buizen, root haren, en mos protonemata, naar elongate via zeer smalle openingen (~ 1 µm) in een microfluidic apparaat.

Ontwikkeling van Microfluidic apparaten te bestuderen van de rek mogelijkheid van plantencellen Tip groeiende in zeer kleine ruimtes

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het veld van plantencelbiologie, zoals hoe puntgroeiende plantencellen fysische celbarrières doordringen. Het grote voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om hoge resolutie beelden te verkrijgen die het vervormingsproces van een cel op micrometer schaal reconstrueren onder een conventionele microscoop. Om een apparaat te maken voor het onderzoek van de groeiende pollenbuisjes en mos protonemata, maak eerst ongeveer 11 gram PDMS en laad het in een vier-inch mal.Vervolgens degasseer de mal gedurende 20 minuten in een vacuümkamer. Daarna, verhard de mal gedurende 90 minuten op 65 graden Celsius. Eenmaal verhard, trek de PDMS laag van de mal en open de toegangsgaten naar het kanaal in de PDMS met een biopsie ponsgereedschap.Stel vervolgens het PDMS en de vijf centimeter glazen schaal bloot aan luchtplasma gedurende 50 seconden. Om het microfluïdische netwerk te verzegelen, drukt u de PDMS laag op de glazen schaal en verhardt het gedurende 30 minuten op 65 graden Celsius. Om een microdevice te maken die ontworpen is voor wortelhaaronderzoek, worden twee mallen geladen en verhardt.Gebruik bij het ponsen van de

development-microfluidic-devices-to-study-elongation-capability-tip

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Beschrijven we een protocol voor de fabricage van microfluïdische apparaten die cel te vangen en cultuur kunnen inschakelen. In deze benadering patroon microstructuren, zoals groeven in microfluïdische kanalen worden gebruikt om lage shear stress regio's waarbinnen de cel kan dock te creëren.

Een microfluïdische apparaat met Groove patronen voor het bestuderen van Cellular Gedrag

We een eenvoudige methode om microfluïdische inrichtingen kunnen toepassen soortgelijke dynamische omstandigheden meerdere verschillende stammen produceren zonder de noodzaak van een clean room of zachte lithografie.

Een microfluïdische apparaat voor het bestuderen van meerdere, afzonderlijke stammen

Source: Cabeen, M. T., et al. Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates the use of a microfluidic device to observe bacterial growth at the single-cell level. It showcases how non-motile bacterial cells, confined within micro-scale trenches, are continuously nourished and imaged under a fluorescence microscope. The setup enables real-time visualization of cell division and lineage tracking across multiple generations.

Tracking Bacterial Growth at Single-Cell Resolution in a Microfluidic System

In dit protocol wordt de fabricage, installatie en basisbediening van een microfluïdische picoliter bioreactor (PLBR) voor single-cel analyse van prokaryotische micro-organismen geïntroduceerd. Industrieel relevante micro-organismen werden geanalyseerd als bewijs van principe, waardoor inzichten in groeisnelheid, morfologie en fenotypische heterogeniteit over bepaalde tijdsperioden mogelijk werden, wat nauwelijks mogelijk is met conventionele methoden.

Microfluïdische Picoliter Bioreactor voor Microbiële Eéncellige Analyse: Fabricage, Systeemopstelling en Werking

We demonstreren een-microfluidics gebaseerde test om de termijn voor de cellen om de doorvoer te meten door middel van een opeenvolging van micron-schaal vernauwingen.

Een Microfluïdische Techniek om Cell Vervormbaarheid Probe

Micro-gefabriceerde apparaten geïntegreerd met vloeistofcomponenten bieden een in vitro platform voor celstudies die het in vivo micro-milieu nabootsen. We ontwikkelden op polymethylmethacrylaat gebaseerde microfluïdische chips voor het bestuderen van cellulaire reacties onder enkele of naast elkaar bestaande chemische/elektrische/schuifspanningsstimuli.

Het ontwerpen van microfluïdische apparaten voor het bestuderen van cellulaire reacties Onder Single of bestaande chemische / Elektro / Shear Stress Stimuli

Presenteren we een methode voor de analyse van de microfluidic van afzonderlijke bacteriële cel lineages met behulp van Bacillus subtilis als voorbeeld. De methode overwint tekortkomingen van de traditionele analysemethoden in microbiologie doordat observatie van honderden cel generaties strak controleerbaar en uniforme groei omstandigheden.

Eencellige Microfluidic analyse van Bacillus subtilis

We beschrijven een methode om apparaten te construeren voor 3D-cultuur en experimenten met cellen en multicellulaire organoids. Dit apparaat maakt analyse van cellulaire reacties op oplosbare signalen in 3D-micromilieus met gedefinieerde chemoattractant gradiënten. Organoids zijn beter dan enkele cellen bij de opsporing van zwakke luidruchtige ingangen.

3D-analyse van multi-cellulaire reacties op chemoattractant gradiënten

Hier bieden we een microfluïdische chip en een automatisch gecontroleerd, zeer efficiënt circulatiemicrofluïdisch systeem dat de initiële micromilieu van neovascularisatie samenvat, waardoor endotheelcellen (EC's) tegelijkertijd kunnen worden gestimuleerd door hoge luminale schuifspanning, fysiologisch niveau van transendotheliale stroom en verschillende vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) distributie tegelijkertijd.

Microfluïdisch model om de eerste gebeurtenis van neovascularisatie na te bootsen

Vanwege de ondoorzichtigheid van de bodem kunnen interacties tussen de samenstellende microben niet gemakkelijk worden gevisualiseerd met cellulaire resolutie. Hier worden twee microfluïdische hulpmiddelen gepresenteerd, die nieuwe mogelijkheden bieden voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties. De apparaten zijn veelzijdig en eenvoudig te gebruiken, waardoor hoge spatiotemporale controle en beeldvorming met hoge resolutie op cellulair niveau mogelijk is.

Microfluïdische hulpmiddelen voor het onderzoeken van schimmel-microbiële interacties op cellulair niveau

Dit protocol beschrijft het ontwerp en de fabricage van een microfluïdisch apparaat dat geschikt is voor het onderzoeken van de mechanica van microtubuli-polymeren. De synthese van microfabricage, geautomatiseerde stroomregeling en computationele modelleringstechnieken maakt een flexibel systeem mogelijk dat bij uitstek geschikt is om het cellulaire cytoskelet in vitro te onderzoeken.

Ontwikkeling van een op microfluïdica gebaseerde benadering voor het onderzoeken van de mechanica van microtubuli-polymeren

Leer hoe tipgroeiende plantencellen door nauwe ruimtes rekken met behulp van een PDMS-microfluidisch apparaat. Deze methode maakt hoogresolutiebeeldvorming van celdeformatie mogelijk voor plantenbiologie.

Ontwikkeling van Microfluidic apparaten te bestuderen van de rek mogelijkheid van plantencellen Tip groeiende in zeer kleine ruimtes (Video) | JoVE Journal

Ontwikkeling van Microfluidic apparaten te bestuderen van de rek mogelijkheid van plantencellen Tip groeiende in zeer kleine ruimtes

Meer video's verkennen