Ontwikkeling van Microfluidic apparaten te bestuderen van de rek mogelijkheid van plantencellen Tip groeiende in zeer kleine ruimtes
May 22nd, 2018
Beschrijven we een methode voor het onderzoeken van de mogelijkheid van tip-groeiende plantencellen, met inbegrip van stuifmeel buizen, root haren, en mos protonemata, naar elongate via zeer smalle openingen (~ 1 µm) in een microfluidic apparaat.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het veld van plantencelbiologie, zoals hoe puntgroeiende plantencellen fysische celbarrières doordringen. Het grote voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om hoge resolutie beelden te verkrijgen die het vervormingsproces van een cel op micrometer schaal reconstrueren onder een conventionele microscoop. Om een apparaat te maken voor het onderzoek van de groeiende pollenbuisjes en mos protonemata, maak eerst ongeveer 11 gram PDMS en laad het in een vier-inch mal.
Vervolgens degasseer de mal gedurende 20 minuten in een vacuümkamer. Daarna, verhard de mal gedurende 90 minuten op 65 graden Celsius. Eenmaal verhard, trek de PDMS laag van de mal en open de toegangsgaten naar het kanaal in de PDMS met een biopsie ponsgereedschap.
Stel vervolgens het PDMS en de vijf centimeter glazen schaal bloot aan luchtplasma gedurende 50 seconden. Om het microfluïdische netwerk te verzegelen, drukt u de PDMS laag op de glazen schaal en verhardt het gedurende 30 minuten op 65 graden Celsius. Om een microdevice te maken die ontworpen is voor wortelhaaronderzoek, worden twee mallen geladen en verhardt.
Gebruik bij het ponsen van de kanaalgaten een twee-millimeter pons. Nadat beide lagen gedurende 50 seconden aan luchtplasma zijn blootgesteld, voegt u ze samen, inclusief een dekglas, onder een stereomicroscoop. Gebruik het op maat gemaakte uitlijngereedschap om dit te bereiken.
Verhardt de samenstelling gedurende 30 minuten in de oven om het microfluïdische netwerk te verzegelen. Verwijder na het verharden het dekglas van het apparaat en breng het over naar een vijf centimeter glazen schaal. Voordat u de pollenbuis microdevice gebruikt, degasseer het gedurende 20 minuten in een vacuümkamer.
Voeg groeimedium toe aan de pistil ingang met behulp van een micropipet met een fijne punt. Laad de andere putjes met hetzelfde medium. Geef een paar minuten om de kanalen te laten vullen.
Plaats ondertussen een vochtige papieren handdoek in de schaal om de lokale luchtvochtigheid te helpen behouden. Verzamel nu pollenkorrels van een T.fournieri blauwe en witte bloem. Breng de korrels over op het stigma met behulp van een dissectienetdel.
Snij vervolgens een centimeter lang bestoven steeltje lengtelings door en steek het gesneden steeltje in de ingang van het microfluïdisch apparaat. Wanneer het gesneden steeltje met behulp van pincetten in de ingang van het microfluïdisch apparaat wordt gestoken, is het belangrijk om het steeltje niet te strak vast te houden, omdat dit het steeltje kan beschadigen. Bevestig vervolgens een deksel op de schaal met behulp van tape en breng de schaal over naar een incubator op 28 graden Celsius waar het vijf tot zes uur in het donker moet blijven.
Begin onder een laminaire stroomkap door transgene A.thaliana Columbia zaden te steriliseren. Week ze vijf minuten in een reinigingsoplossing. Spoel de zaden vervolgens grondig in autoclaved water.
Na sterilisatie, bewaar de zaden gedurende 48 uur bij vier graden Celsius in het donker. Enkele dagen later degasseer de microdevice gedurende 20 minuten voordat u het gebruikt. Laad vervolgens het juiste groeimedium in de putjes van het apparaat met behulp van een fijne pipetten en wacht een paar minuten tot de oplossing door alle kanalen is getrokken.
Laad ook wat vochtige papieren handdoek op de schaal om de luchtvochtigheid te behouden. Breng nu een voorbereide zaad over naar de ingang van het apparaat. Bevestig vervolgens het deksel met behulp van tape en breng de schaal over naar een incubator van 22 graden Celsius met continue licht.
Steriliseer de microdevice vóór gebruik gedurende een nacht onder UV. De volgende dag degasseer de microdevice gedurende 20 minuten. Eenmaal gedegasseerd, laad de microwells met het juiste groeimedium.
Terwijl de kanalen geleidelijk vullen, omring het microdevice met wat autoclaved water om de luchtvochtigheid te behouden. Breng een klein stukje mos protonemata weefsel over naar de ingang van het microdevice. Cultiveer nu het apparaat op 25 graden Celsius onder continue licht.
Na twee tot drie weken groei, neem helderveldbeelden van de resultaten onder een microscoop. Puntgroeiende plantencellen ondervinden een reeks fysische barrières langs hun groeipad in vivo, zoals in de transmissietractus en bij de micropyle, om nog maar te zwijgen van het pad van wortelharen in de grond. De gepresenteerde microfluïdische in vitro celcultuurplatformen maken het mogelijk om het puntgroeiproces te onderzoeken in drie soorten plantencellen, pollenbuisjes, wortelharen en mos protonemata.
Het bekijken wordt bereikt door één-micron gaten in de apparaten. Omdat micro-gaten van deze grootte kwetsbaar zijn, zullen ze soms sluiten, vooral na herhaald gebruik. Daarom is het belangrijk om te verifiëren dat de gaten intact zijn voordat u de experimenten uitvoert.
Voor het pollenbuis onderzoek, werd levend-cel beeldvorming gebruikt om morfologische veranderingen in het apicale gebied van pollenbuisjes te monitoren, evenals de vegetatieve kern en spermacellen in reactie op het tegenkomen van een extreem kleine ruimte. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van plantencelbiologie om de verlengingscapaciteit van puntgroeiende plantencellen, zoals pollenbuisjes, wortelharen en mos protonemata in een extreem kleine ruimte te onderzoeken.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode om de verlengingscapaciteit van tip-groeiende plantencellen, zoals pollenbuizen en mos protonemata, door smalle openingen in een microfluïdisch apparaat te onderzoeken. De techniek maakt hoge resolutie beeldvorming van celdeformatieprocessen op micrometerschaal mogelijk.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Plantencelbiologie
- Microfluidica
- Cellulaire mechanica
Achtergrond
- Tip-groeiende plantencellen spelen een cruciale rol in de ontwikkeling van planten.
- Het begrijpen van hoe deze cellen fysieke barrières doordringen is essentieel voor de vooruitgang in de plantenbiologie.
- Microfluïdische apparaten kunnen smalle omgevingen simuleren voor celstudie.
- Hoge resolutie beeldvormingstechnieken zijn essentieel voor het observeren van cellulaire processen.
Doel van de studie
- Om het vermogen van tip-groeiende plantencellen om door smalle openingen te verlengen te onderzoeken.
- Om inzichten te geven in de mechanismen van celdoordringing door barrières.
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het bestuderen van celdeformatie in gecontroleerde omgevingen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van een PDMS microfluïdisch apparaat.
- Degassing van de mal in een vacuümkamer.
- Het uitharden van de PDMS bij 65 graden Celsius.
- Het creëren van toegangsgaten in de PDMS met behulp van een biopsie-punch gereedschap.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt met succes de observatie van pollenbuizen en mos protonemata mogelijk.
- Hoge resolutie beelden onthullen de deformatieprocessen van cellen.
- Cellen kunnen zich door openingen verlengen zo klein als 1 µm.
- De techniek levert waardevolle gegevens voor het begrijpen van celgedrag in beperkte ruimtes.
Conclusies
- Deze methode verbetert het begrip van tip-groeiende plantencellen.
- Het biedt een nieuwe benadering om cellulaire mechanica in de plantenbiologie te bestuderen.
- De bevindingen kunnen implicaties hebben voor landbouwkundig en biologisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Studying tip-growing plant cell behavior in physically constrained environments provides mechanistic insights into cellular adaptation under mechanical stress, relevant for understanding growth regulation in complex tissues. This microfluidic platform enables high-resolution visualization of subcellular dynamics during barrier penetration, supporting hypothesis testing in cellular mechanics and predictive modeling of growth responses. The approach offers a scalable in vitro system to de-risk target validation in plant developmental pathways by linking physical constraints to molecular readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how physical constraints influence tip growth dynamics and subcellular reorganization in live cells.
- Operational Value: Provides a reproducible platform to correlate gap size with elongation success rates across cell types.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by revealing whether cytoskeletal or nuclear positioning changes are required for barrier transit.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts on penetration efficiency and morphological changes under controlled micron-scale confinement.
- Operational Value: Standardizes gap dimensions (e.g., ~1 µm) to ensure assay consistency across experiments and laboratories.
- Scalability: Permits parallel testing of multiple cell lines or genetic variants in identical microfluidic networks.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects cellular responses to physical stress with potential biomarkers of growth adaptation or failure.
- Operational Value: Enables time-lapse tracking of fluorescently labeled components (e.g., nucleus, sperm cells) to correlate structural changes with functional outcomes.
- Predictive Confidence: Offers a disease-relevant system analog for studying how cells navigate restrictive microenvironments, analogous to extracellular matrix penetration in mammalian systems.
Pipeline & Workflow Integration
The microfluidic elongation assay fits within early discovery workflows where understanding cellular responses to physical cues informs target selection and pathway validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on how mechanical confinement alters tip growth kinetics and intracellular trafficking.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable outputs on cell deformation and transit success for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables measurement of elongation rates, nuclear displacement, and shape recovery as dependent variables for condition comparison.
- Translational Research: Provides a disease-relevant system to model how cells adapt to spatial constraints, supporting extrapolation to invasive growth phenotypes.
- Enterprise Reuse: Reusable PDMS-glass platforms allow longitudinal studies and cross-project standardization in mechanobiology screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces ambiguity in linking physical stimuli to cellular responses by enabling direct observation of deformation processes.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fabrication, plasma bonding, and gap verification steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by clarifying whether observed growth defects stem from intrinsic capacity or extrinsic barrier resistance.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on their resilience to mechanical stress in confined microenvironments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, PDMS handling, and sterile cell culture techniques.
- Depends on access to vacuum degassing equipment, plasma treatment systems, and precision punch tools for channel formation.
- Necessitates standardized protocols for gap integrity verification prior to each experiment to prevent false-negative results.
- Involves adaptation considerations when transferring the system between pollen tubes, root hairs, and moss protonemata due to differing growth rates and medium needs.
- Limited by the fragility of sub-micron gaps, which may deform or close after repeated use, requiring routine inspection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:28
Fabricating the PDMS Microdevices
2:11
In Vitro Culturing of T. fournieri Pollen Tubes in the Microdevice
3:31
In Vitro Culturing of A. thaliana Root Hairs in the Microdevice
4:40
In Vitro Culturing of P. patens (moss) Protonemata in the Microfluidic Device
5:31
Results: Microfluidic Device Design and Time-lapse Imaging of Pollen Tube Growth
6:37
Conclusion
