ExCYT: Een grafische gebruikersinterface voor het stroomlijnen van de analyse van High-dimensionale Cytometry gegevens

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op biomedisch gebied, zoals het begrijpen van het fenotype van biologisch relevante subpopulaties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een individu zonder programmeerervaring in staat stelt om hun cytometriegegevens te analyseren met de nieuwste hoogdimensionale technieken. Als u een analysepijplijn wilt starten, selecteert u eerst het type cytometrie en het aantal gebeurtenissen dat u uit het bestand moet samplen.

Klik vervolgens op Poortpopulatie, selecteer de celpopulaties van belang en voer het percentage gebeurtenissen in voor downstream-analyse. Selecteer vervolgens het aantal kanalen dat moet worden gebruikt voor de analyse in het keuzelijstje. Voor T-distributed Stochastic Neighbor Embedding of t-SNE-analyse klikt u op t-SNE om te beginnen met het berekenen van de gegevensset voor verminderde dimensionaliteit.

Wanneer de set is berekend, klikt u op TSNE-afbeelding opslaan en selecteert u in het pop-upmenu Markeriek t-SNE een specifieke markering van belang. Er verschijnt een cijfer met een warmtekaartweergave van het t-SNE-plot dat kan worden opgeslagen voor het genereren van cijfers. Als u wilt beginnen met clusteranalyse, selecteert u een optie in het keuzevak Clusteringmethode en klikt u op Cluster.

Als u de clusters wilt sorteren op een markering van belang, selecteert u de juiste bijbehorende optie in het pop-upmenu Sorteren en klikt u op Oplopend, Aflopend om de lijst met clusters in het keuzevak van clusters bij te werken. Als u een minimale drempelwaarde voor een bepaald cluster wilt instellen voor een bepaald kanaal, selecteert u een optie in het pop-upmenu Drempel en stelt u een geschikte drempelwaarde in. Zodra de drempelwaarde is ingesteld, klikt u op Boven drempelwaarde toevoegen of Onder drempelwaarde toevoegen om de richting van de drempelwaarde op te geven en voert u een numerieke cut-off in het vak Clusterfrequentiedrempel in het deelvenster Clusterfilter om een minimale drempel voor de frequentie van een cluster in te stellen.

Als u clusters wilt selecteren voor verdere analysealualisatie, selecteert u de clusters van belang in het vak Clusters. En gebruik de knop Selecteren om de opties te verplaatsen naar het keuzevak Clusteranalyse. Als u warmtekaarten van de clusters wilt maken, selecteert u de clusters van belang in het keuzelijstje Clusteranalyse en klikt u op de knop HeatMap of Clusters.

Als u een hoogdimensionaal vakplot of een hoogdimensionale stroomplot wilt maken, selecteert u de clusters van belang in het keuzelijstje Clusteranalyse en klikt u op Hoogdimensionale vakplot of Hoogdimensionale stroomplot om de verdeling van bepaalde kanalen van verschillende clusters over alle dimensies visueel te beoordelen. Als u clusters in traditionele 2D-stroomplots wilt weergeven, selecteert u de juiste transformatie en het juiste kanaal in het deelvenster Conventionele stroomplot en klikt u op Conventionele stroomplot. Hier wordt een representatieve t-SNE analyse van warmtekaarten voor verschillende markers binnen een myeloïde paneel analysepijplijn getoond.

Met behulp van de snelle hebzuchtige implementatie binnen ExCYT om de gegevens te clusteren met 100.000 van de dichtstbijzijnde buren, werden 19 subpopulaties van cellen onthuld. Door de oorspronkelijke warmtekaarten te vergelijken met de clusters die door ExCYT zijn gemaakt, konden vergelijkbare clusters van de myeloïde cellen tussen de twee gegevensgroepen worden geïdentificeerd. Analyse van het lymfepaneel met een meer conventionele en snellere hiërarchische clustering benadering, leverde vergelijkbare marker distributies via t-SNE heat maps.

Verder toonde clustering van de gegevens via hiërarchische clustering vergelijkbare clusters van lymfoïdecellen aan. Met name, een unieke regelgevende T-cel populatie werd ook geïdentificeerd via een hoog-dimensionale stroom plot. Om co-associaties tussen markers snel en kwantitatief te beoordelen, werd eerst een hard K-means clustering algoritme gebruikt om 5000 clusters op de tweedimensionale t-SNE-gegevens vast te leggen.

De mediane expressie van alle markers uit alle clusters werd vervolgens gebruikt, om een warmtekaart uit deze clusters te maken, waardoor co-associaties gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd, zoals de co-associatie van Tim-3, PD-1, CD38 en 4-1BB. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de verschillende parameters te verkennen, zoals verschillende clustering methoden, om volledig te verkennen van de gegevens die u bestudeert.