ExCYT: Een grafische gebruikersinterface voor het stroomlijnen van de analyse van High-dimensionale Cytometry gegevens
16 januari 2019
ExCYT is een MATLAB gebaseerde grafische User Interface (GUI) waarmee gebruikers hun stroom cytometry om gegevens te analyseren via algemeen gebruikte analytische technieken voor high-dimensional data waaronder dimensionaliteit vermindering via t-GND, een aantal handmatige en geautomatiseerde Clustering van de methoden, heatmaps en roman high-dimensionale stroom percelen.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op biomedisch gebied, zoals het begrijpen van het fenotype van biologisch relevante subpopulaties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een individu zonder programmeerervaring in staat stelt om hun cytometriegegevens te analyseren met de nieuwste hoogdimensionale technieken. Als u een analysepijplijn wilt starten, selecteert u eerst het type cytometrie en het aantal gebeurtenissen dat u uit het bestand moet samplen.
Klik vervolgens op Poortpopulatie, selecteer de celpopulaties van belang en voer het percentage gebeurtenissen in voor downstream-analyse. Selecteer vervolgens het aantal kanalen dat moet worden gebruikt voor de analyse in het keuzelijstje. Voor T-distributed Stochastic Neighbor Embedding of t-SNE-analyse klikt u op t-SNE om te beginnen met het berekenen van de gegevensset voor verminderde dimensionaliteit.
Wanneer de set is berekend, klikt u op TSNE-afbeelding opslaan en selecteert u in het pop-upmenu Markeriek t-SNE een specifieke markering van belang. Er verschijnt een cijfer met een warmtekaartweergave van het t-SNE-plot dat kan worden opgeslagen voor het genereren van cijfers. Als u wilt beginnen met clusteranalyse, selecteert u een optie in het keuzevak Clusteringmethode en klikt u op Cluster.
Als u de clusters wilt sorteren op een markering van belang, selecteert u de juiste bijbehorende optie in het pop-upmenu Sorteren en klikt u op Oplopend, Aflopend om de lijst met clusters in het keuzevak van clusters bij te werken. Als u een minimale drempelwaarde voor een bepaald cluster wilt instellen voor een bepaald kanaal, selecteert u een optie in het pop-upmenu Drempel en stelt u een geschikte drempelwaarde in. Zodra de drempelwaarde is ingesteld, klikt u op Boven drempelwaarde toevoegen of Onder drempelwaarde toevoegen om de richting van de drempelwaarde op te geven en voert u een numerieke cut-off in het vak Clusterfrequentiedrempel in het deelvenster Clusterfilter om een minimale drempel voor de frequentie van een cluster in te stellen.
Als u clusters wilt selecteren voor verdere analysealualisatie, selecteert u de clusters van belang in het vak Clusters. En gebruik de knop Selecteren om de opties te verplaatsen naar het keuzevak Clusteranalyse. Als u warmtekaarten van de clusters wilt maken, selecteert u de clusters van belang in het keuzelijstje Clusteranalyse en klikt u op de knop HeatMap of Clusters.
Als u een hoogdimensionaal vakplot of een hoogdimensionale stroomplot wilt maken, selecteert u de clusters van belang in het keuzelijstje Clusteranalyse en klikt u op Hoogdimensionale vakplot of Hoogdimensionale stroomplot om de verdeling van bepaalde kanalen van verschillende clusters over alle dimensies visueel te beoordelen. Als u clusters in traditionele 2D-stroomplots wilt weergeven, selecteert u de juiste transformatie en het juiste kanaal in het deelvenster Conventionele stroomplot en klikt u op Conventionele stroomplot. Hier wordt een representatieve t-SNE analyse van warmtekaarten voor verschillende markers binnen een myeloïde paneel analysepijplijn getoond.
Met behulp van de snelle hebzuchtige implementatie binnen ExCYT om de gegevens te clusteren met 100.000 van de dichtstbijzijnde buren, werden 19 subpopulaties van cellen onthuld. Door de oorspronkelijke warmtekaarten te vergelijken met de clusters die door ExCYT zijn gemaakt, konden vergelijkbare clusters van de myeloïde cellen tussen de twee gegevensgroepen worden geïdentificeerd. Analyse van het lymfepaneel met een meer conventionele en snellere hiërarchische clustering benadering, leverde vergelijkbare marker distributies via t-SNE heat maps.
Verder toonde clustering van de gegevens via hiërarchische clustering vergelijkbare clusters van lymfoïdecellen aan. Met name, een unieke regelgevende T-cel populatie werd ook geïdentificeerd via een hoog-dimensionale stroom plot. Om co-associaties tussen markers snel en kwantitatief te beoordelen, werd eerst een hard K-means clustering algoritme gebruikt om 5000 clusters op de tweedimensionale t-SNE-gegevens vast te leggen.
De mediane expressie van alle markers uit alle clusters werd vervolgens gebruikt, om een warmtekaart uit deze clusters te maken, waardoor co-associaties gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd, zoals de co-associatie van Tim-3, PD-1, CD38 en 4-1BB. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de verschillende parameters te verkennen, zoals verschillende clustering methoden, om volledig te verkennen van de gegevens die u bestudeert.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
ExCYT is een op MATLAB gebaseerde GUI die is ontworpen voor het analyseren van flowcytometriegegevens met behulp van geavanceerde analysetechnieken. Hiermee kunnen gebruikers zonder programmeerervaring dimensionaliteitsreductie, clustering en visualisatie van hoogdimensionale gegevens uitvoeren.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Flowcytometrie
- Data-analyse
- Biomedisch onderzoek
Achtergrond
- Flowcytometrie is essentieel voor het analyseren van celpopulaties.
- Hoogdimensionale data-analyse is noodzakelijk voor het begrijpen van complexe biologische systemen.
- ExCYT vereenvoudigt het analyseproces voor niet-programmeurs.
- Technieken voor dimensiereductie, zoals t-SNE, zijn cruciaal voor het visualiseren van gegevens.
Doel van de studie
- Om een gebruiksvriendelijke interface te bieden voor de analyse van flowcytometriegegevens.
- Om het begrip van biologisch relevante subpopulaties te vergemakkelijken.
- Om onderzoekers in staat te stellen geavanceerde analysetechnieken te gebruiken zonder dat hiervoor programmeerkennis vereist is.
Gebruikte methoden
- Selectie van het cytometry-type en event-sampling.
- Gating van celpopulaties voor analyse.
- Gebruik van t-SNE voor dimensiereductie.
- Creatie van heatmaps en hoogdimensionele flow-plots.
Belangrijkste Resultaten
- ExCYT maakt een effectieve analyse van complexe flowcytometriegegevens mogelijk.
- Gebruikers kunnen hoogdimensionale datasets eenvoudig visualiseren en interpreteren.
- De GUI ondersteunt zowel geautomatiseerde als handmatige clusteringmethoden.
- Faciliteert de identificatie van relevante celpopulaties.
Conclusies
- ExCYT is een krachtige tool voor onderzoekers in het biomedische veld.
- Het democratiseert de toegang tot geavanceerde data-analysetechnieken.
- De software verbetert het begrip van cellulaire fenotypes.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
ExCYT biedt een oplossing voor de groeiende uitdaging bij het analyseren van hoogdimensionale cytometriegegevens in drug discovery door een no-code interface voor geavanceerde analysetechnieken te bieden. Dit maakt een bredere toegang tot workflows voor fenotypische screening en target-validatie mogelijk, waardoor de afhankelijkheid van bio-informatica-specialisten wordt verminderd en besluitvorming in de vroege ontdekkingsfase wordt versneld. De tool ondersteunt mechanistische risicoreductie door de objectieve identificatie van biologisch relevante subpopulaties uit complexe datasets te faciliteren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door onbevooroordeelde fenotypische exploratie van cellulaire heterogeniteit.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door het identificeren en karakteriseren van drug-responsieve celpopulaties zonder bias door handmatige gating.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in targetselectie door co-expressiepatronen van immuun-checkpoints en activatiemarkers te onthullen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door fenotypisch onderscheidende clusters te definiëren met behulp van t-SNE en clustering.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie van assays via reproduceerbare dimensiereductie en clusteridentificatie over gecompenseerde en niet-gecompenseerde FCS-bestanden.
- Schaalbaarheid: Maakt hergebruik van het platform mogelijk voor diverse immunologie- en oncologiepanels via flexibele kanaalselectie en drempelwaarde-gebaseerde filtering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Ondersteunt systeemanalyses die relevant zijn voor ziekten door marker-coassociaties (bijv. Tim-3, PD-1, CD38, 4-1BB) te koppelen aan functionele fenotypen.
- Mechanistische risicoreductie: Faciliteert preklinische validatie door het visualiseren van hoogdimensionale flow-plots die zeldzame populaties, zoals regulatoire T-cellen, onthullen.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Maakt datagedreven go/no-go-beslissingen mogelijk via kwantitatieve drempelwaarden voor clusterfrequenties en sorteercapaciteiten.
Integratie van Pipeline & Workflow
ExCYT past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypothesetoetsing tot leadidentificatie, door ruwe cytometriedata om te zetten in bruikbare fenotypische inzichten die de doelwitselectie en de gereedheid voor compoundscreening informeren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door objectieve clustering van immunofenotypes uit hoogdimensionale panels mogelijk te maken.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via reproduceerbare t-SNE-visualisatie en clusterisolatie voor downstream functionele validatie.
- Analytics: Levert kwantitatieve outputs, waaronder heatmaps, drempelwaarden voor clusterfrequenties en hoogdimensionale flow-plots voor vergelijking tussen verschillende condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt discovery-fases met preklinisch werk door translationeel relevante co-expressiepatronen van biomarkers te identificeren.
- Enterprise Hergebruik: Fungeert als een herbruikbaar analytisch platform over projecten heen dankzij de ondersteuning voor diverse cytometrietypes en ongesuperviseerde/gesuperviseerde workflows.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit te verminderen via onbevooroordeelde clustering.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid via GUI-gestuurde automatisering van t-SNE-, clustering- en gating-workflows.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door een breder team toegang te geven tot geavanceerde analyses, waardoor knelpunten bij de interpretatie van gegevens worden verminderd.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door kwantitatieve clustermetrieken te leveren die beslissingen over verdere ontwikkeling informeren.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist bekendheid met het experimentele ontwerp voor cytometrie en de selectie van markerpanels.
- Vereist een MATLAB runtime-omgeving en toegang tot de FCS-bestandsgegevensinfrastructuur.
- Baten bij standaardisatie tussen teams wat betreft gating-strategieën en clusteringparameters voor reproduceerbare resultaten.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten het bijstellen van de t-SNE perplexiteit en clusterdrempels op basis van de complexiteit van het biologische systeem.
- Praktische beperking: De prestaties kunnen variëren bij extreem grote datasets (>1M events) zonder downstream sampling.
