Visualisatie en kwantificering van High-dimensionale Cytometrie gegevens met behulp van Cytofast en de upstream clustering methoden FlowSOM en Cytosplore
12 december 2019
Cytofast is een visualisatietool die wordt gebruikt om de uitvoer van clustering te analyseren. Cytofast kan worden gebruikt om twee clustering methoden te vergelijken: Flowsom en cytosplore. Cytofast kan snel een kwantitatief en kwalitatief overzicht van Mass cytometrie gegevens genereren en de belangrijkste verschillen tussen verschillende clustering algoritmen benadrukken.
De gegevens gegenereerd door massa cytometrie zijn complex en moeten worden gevisualiseerd op een efficiënte manier en eenvoudige manier. Cytofast is een methode die immunologische patronen binnen de immuuncelpopulatie benadrukt en celsubsets bepaalt die gekoppeld zijn aan klinische behandelingen of experimentele groepen. Cytofast kan worden toegepast na een kristalmethode zoals FlowSOM of Cytosplore.
Het zal u toelaten om een cel subset die zijn gekoppeld aan klinische behandeling of een experimentele groep te ontdekken. Met deze methode u het immunologische overzicht van de gegevens in één oogopslag kwantitatief bekijken. Begin met het maken van clusters met Cytosplore of FlowSOM.
Als u Cytosplore gebruikt, uploadt u de FCS-bestanden door op Bestanden te klikken en FCS-bestanden te openen. Selecteer vervolgens een cofactor voor Hyperbolische ArcSinh-transformatie wanneer daarom wordt gevraagd en klik op het toevoegen van een unieke voorbeeldtag als kanaal. Selecteer HSNE uitvoeren om een HSNE-niveau van drie uit te voeren en wacht tot de kaart is gegenereerd.
Controleer op het eerste HSNE-niveau de cellen die positief zijn voor CD161 door de cd161-positieve cellen te selecteren en met de rechtermuisknop in te zoomen op selectie. Herhaal op het tweede niveau de procedure om het derde niveau te bereiken met alleen CD161-positieve gebeurtenissen. Zodra de laatste TSNE-kaart is gegenereerd, sla je de clusters op die door Cytosplore zijn gedefinieerd door met de rechtermuisknop op de kaart te klikken en saveclusters te kiezen.
Kies de map van de uitvoerbestanden in opdracht van Cytosplore en noteer deze locatie omdat deze later wordt gebruikt om FSC-bestanden in R.Use een eenvoudige naam alleen bij het wijzigen van de uitvoerbestanden die identificatie en verdere verwerking gemakkelijker maken en opslaan selecteren. Laad de bestanden in R met de aangewezen functie readcytosploreFCS. Als u de gegevens wilt reinigen, verwijdert u bepaalde parameters, zoals tijd en achtergrond, door de positie van de kolom met betrekking tot de onnodige parameters te controleren en uit de matrix te verwijderen.
Vervolgens worden de markeringen opnieuw geordend, zodat lijnmarkeringen eerst worden weergegeven, gevolgd door functionele markeringen. Koppel het metagegevensbestand aan de gegenereerde gegevens van Cytosplore door de spreadsheet metafile met klinische informatie te uploaden. Als u clustering wilt uitvoeren door FlowSOM, laadt u de ruwe gegevens die eerder op CD161-positieve gebeurtenissen in R zijn gesloten met de read.
flowSet, functie. Selecteer de relevante biologische markers door de juiste kolommen te selecteren en de gegevens op een ArcSinh5-manier te transformeren. Breng een cofactor van vijf aan door cofacter=5 in de functie te kiezen.
Cluster de gegevens met behulp van de FlowSOM-functie en vergelijk FlwoSOM en Cytosplore door ervoor te kiezen de gegevens in 10 subsets te clusteren, hetzelfde als de uitvoer die eerder door Cytosplore werd opgeleverd. Wijs vervolgens elke cel toe aan de geïdentificeerde subset en voorbeeld-ID.Laad het metagegevensbestand in R met de groepstoewijzing en koppel deze aan de FCS-bestanden met behulp van de code uit het tekstmanuscript. Maak een CF-lijst op basis van het gegevensframe dat is verkregen uit FlowSOM.
Bestel vervolgens de markeringen om op dezelfde manier te verschijnen als de uitvoer uit de Cytosplore-analyse. Voordat u de warmtekaarten maakt, genereert u de teltabel per voorbeeld met behulp van de functiecelCount. Aangezien sommige clusters minder cellen bevatten dan andere, schaalt u de gegevens per cluster op door scale=true in de functie op te geven, waardoor de verspreiding tussen de monsters gemakkelijk te zien is.
Visualiseer de gegevens met een heatmap en visualiseer vervolgens met boxplots door het aantal cellen te genereren, maar niet om de gegevens te schalen om de frequentie van elk cluster te verkrijgen. Visualiseer ten slotte de expressieintensiteit van de CD45-, CD11c- en CD54-markeringen door de noterende merknamen en voeg deze op in de MSI-plotfunctie. Cytofast voert verschillende mogelijke uitgangen uit, waaronder de heatmap van alle clusters die in de analyse zijn geïdentificeerd en op basis van markeringsexpressie.
Het dendrogram aan de bovenkant vertegenwoordigt de hiërarchische gelijkenis tussen de geïdentificeerde clusters. Het bovenste paneel toont een andere warmtekaart met de relatieve hoeveelheid overeenkomstige subsets in elk monster. Ondertussen toont het dendrogram aan de rechterkant de gelijkenis tussen monsters op basis van subsetfrequenties waaruit blijkt dat het fenotype van natuurlijke killer cellen wordt gevormd door PD-L1 behandeling drie dagen na injectie.
De gecombineerde warmtekaarten zijn te verkrijgen voor FlowSOM gevolgd door Cytofast en voor Cytosplore gevolgd door Cytofast. Cytofast kan ook worden gebruikt om de gegevens kwantitatief te presenteren en de resultaten weer te geven in box plots. Een andere functie die is opgenomen in het Cytofast-pakket is de MSI-plotfunctie die de mediane signaalintensiteit van elke marker per groep weergeeft.
Deze functie maakt detectie van globale veranderingen mogelijk, zoals toename van de expressie van CD54 of CD11c in natuurlijke killercellen van de PD-L1 behandelde groep. Deze techniek is een snelle manier om gegevens te visualiseren en te kwantificeren en kan worden gebruikt om nieuwe cellulaire reacties na de therapie te ontdekken. Na deze methode kan het globale testpakket in R worden gebruikt om een groep covariaten te testen op associatie met responsvariabelen.
Dit toont de correlatie tussen elke subsets en de klinische uitkomst.
Overzicht
Cytofast is een visualisatietool die is ontworpen om massa-cytometriegegevens te analyseren door clusteringmethoden zoals FlowSOM en Cytosplore te vergelijken. Het biedt een snel kwantitatief en kwalitatief overzicht van de gegevens en benadrukt verschillen tussen clusteringalgoritmen.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Massa-cytometrie
- Gegevensvisualisatie
- Clusteranalyse
Achtergrond
- Massa-cytometrie genereert complexe gegevens die efficiënte visualisatie vereisen.
- Cytofast identificeert immunologische patronen binnen immuuncelpopulaties.
- Het kan worden toegepast na clusteringmethoden zoals FlowSOM of Cytosplore.
- Begrip van celsubsets die verband houden met klinische behandelingen is cruciaal voor onderzoek.
Doel van de studie
- Om een tool te bieden voor het visualiseren en kwantificeren van massa-cytometriegegevens.
- Om verschillende clusteringmethoden effectief te vergelijken.
- Om de ontdekking van celsubsets gerelateerd aan klinische uitkomsten te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Clusters worden gemaakt met behulp van Cytosplore of FlowSOM.
- Gegevens worden getransformeerd en opgeruimd in R voor analyse.
- Clustering wordt uitgevoerd en resultaten worden gevisualiseerd door middel van heatmaps en boxplots.
- De MSI plot functie wordt gebruikt om globale veranderingen in markerexpressie te detecteren.
Belangrijkste resultaten
- Cytofast genereert heatmaps en dendrogrammen om clusteringresultaten te illustreren.
- Het benadrukt de impact van behandelingen op natuurlijke killercelfenotypes.
- Kwantitatieve resultaten worden gepresenteerd door middel van boxplots en MSI plots.
- De tool maakt snelle visualisatie en kwantificering van cellulaire reacties mogelijk.
Conclusies
- Cytofast is een effectieve tool voor het analyseren van massa-cytometriegegevens.
- Het verbetert het begrip van immuuncelsubsets in relatie tot behandelingen.
- De methode ondersteunt de ontdekking van nieuwe cellulaire reacties na therapie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Mass cytometry generates high-dimensional immune profiling data that require rapid visualization and quantification to support target validation and mechanistic de-risking in immunotherapy development. Cytofast enables biopharma R&D teams to compare clustering outputs from FlowSOM and Cytosplore, facilitating hypothesis testing of immune cell subset responses to PD-L1 blockade. This accelerates go/no-go decisions by providing quantitative, reproducible readouts of NK cell activation and phenotypic shifts in the tumor microenvironment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking immune cell subsets to clinical treatments or experimental groups.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative comparison of cluster abundance and marker expression across conditions.
- Predictive Confidence: Enhances confidence in target mechanisms by visualizing PD-L1-induced changes in NK cell activation markers like CD54 and CD11c.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems from clustering outputs for downstream compound screening and biomarker evaluation.
- Reproducibility: Standardizes data transformation and cleaning steps (e.g., ArcSinh transformation, parameter removal) to ensure consistent inputs across experiments.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple samples and conditions via automated R-based workflows for heat maps, box plots, and MSI plots.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models immune modulation in the tumor microenvironment, specifically NK cell responses to immunotherapy, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by quantifying immune subset frequencies and functional states prior to in vivo studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by identifying reproducible immunological patterns linked to therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
Cytofast integrates into the discovery continuum from early immune profiling through lead identification to preclinical validation, enabling data-driven progression of immunotherapy candidates.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying cell subsets associated with experimental groups or clinical outcomes.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs (e.g., scaled cluster frequencies) for reliable compound or modulator evaluation.
- Analytics: Provides MSI plots and heat maps that quantify marker expression intensity and subset dispersion, enabling cross-condition comparisons.
- Translational Research: Connects immune phenotyping to preclinical continuity by linking NK cell activation states to immunotherapy mechanisms.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable analytical module applicable across multiple immunotherapy projects and immune monitoring campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in immune responses to checkpoint blockade.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through scripted R workflows and consistent preprocessing steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of immunotherapy targets through quantitative immune profiling.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying immunological signatures of response that inform advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass cytometry data analysis, R programming, and clustering interpretation (FlowSOM, Cytosplore, HSNE/t-SNE).
- Depends on instrumentation for CyTOF data acquisition and computational infrastructure for R-based processing and visualization.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies, marker panels, and metadata annotation for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying workflows to different immune cell types, disease models, or therapeutic modalities beyond NK cells and PD-L1 blockade.
- Limited by the quality of upstream clustering and the need for manual optimization of parameters (e.g., cofactor, cluster number) in Cytosplore and FlowSOM steps.
