Visualisatie en kwantificering van High-dimensionale Cytometrie gegevens met behulp van Cytofast en de upstream clustering methoden FlowSOM en Cytosplore

De gegevens gegenereerd door massa cytometrie zijn complex en moeten worden gevisualiseerd op een efficiënte manier en eenvoudige manier. Cytofast is een methode die immunologische patronen binnen de immuuncelpopulatie benadrukt en celsubsets bepaalt die gekoppeld zijn aan klinische behandelingen of experimentele groepen. Cytofast kan worden toegepast na een kristalmethode zoals FlowSOM of Cytosplore.

Het zal u toelaten om een cel subset die zijn gekoppeld aan klinische behandeling of een experimentele groep te ontdekken. Met deze methode u het immunologische overzicht van de gegevens in één oogopslag kwantitatief bekijken. Begin met het maken van clusters met Cytosplore of FlowSOM.

Als u Cytosplore gebruikt, uploadt u de FCS-bestanden door op Bestanden te klikken en FCS-bestanden te openen. Selecteer vervolgens een cofactor voor Hyperbolische ArcSinh-transformatie wanneer daarom wordt gevraagd en klik op het toevoegen van een unieke voorbeeldtag als kanaal. Selecteer HSNE uitvoeren om een HSNE-niveau van drie uit te voeren en wacht tot de kaart is gegenereerd.

Controleer op het eerste HSNE-niveau de cellen die positief zijn voor CD161 door de cd161-positieve cellen te selecteren en met de rechtermuisknop in te zoomen op selectie. Herhaal op het tweede niveau de procedure om het derde niveau te bereiken met alleen CD161-positieve gebeurtenissen. Zodra de laatste TSNE-kaart is gegenereerd, sla je de clusters op die door Cytosplore zijn gedefinieerd door met de rechtermuisknop op de kaart te klikken en saveclusters te kiezen.

Kies de map van de uitvoerbestanden in opdracht van Cytosplore en noteer deze locatie omdat deze later wordt gebruikt om FSC-bestanden in R.Use een eenvoudige naam alleen bij het wijzigen van de uitvoerbestanden die identificatie en verdere verwerking gemakkelijker maken en opslaan selecteren. Laad de bestanden in R met de aangewezen functie readcytosploreFCS. Als u de gegevens wilt reinigen, verwijdert u bepaalde parameters, zoals tijd en achtergrond, door de positie van de kolom met betrekking tot de onnodige parameters te controleren en uit de matrix te verwijderen.

Vervolgens worden de markeringen opnieuw geordend, zodat lijnmarkeringen eerst worden weergegeven, gevolgd door functionele markeringen. Koppel het metagegevensbestand aan de gegenereerde gegevens van Cytosplore door de spreadsheet metafile met klinische informatie te uploaden. Als u clustering wilt uitvoeren door FlowSOM, laadt u de ruwe gegevens die eerder op CD161-positieve gebeurtenissen in R zijn gesloten met de read.

flowSet, functie. Selecteer de relevante biologische markers door de juiste kolommen te selecteren en de gegevens op een ArcSinh5-manier te transformeren. Breng een cofactor van vijf aan door cofacter=5 in de functie te kiezen.

Cluster de gegevens met behulp van de FlowSOM-functie en vergelijk FlwoSOM en Cytosplore door ervoor te kiezen de gegevens in 10 subsets te clusteren, hetzelfde als de uitvoer die eerder door Cytosplore werd opgeleverd. Wijs vervolgens elke cel toe aan de geïdentificeerde subset en voorbeeld-ID.Laad het metagegevensbestand in R met de groepstoewijzing en koppel deze aan de FCS-bestanden met behulp van de code uit het tekstmanuscript. Maak een CF-lijst op basis van het gegevensframe dat is verkregen uit FlowSOM.

Bestel vervolgens de markeringen om op dezelfde manier te verschijnen als de uitvoer uit de Cytosplore-analyse. Voordat u de warmtekaarten maakt, genereert u de teltabel per voorbeeld met behulp van de functiecelCount. Aangezien sommige clusters minder cellen bevatten dan andere, schaalt u de gegevens per cluster op door scale=true in de functie op te geven, waardoor de verspreiding tussen de monsters gemakkelijk te zien is.

Visualiseer de gegevens met een heatmap en visualiseer vervolgens met boxplots door het aantal cellen te genereren, maar niet om de gegevens te schalen om de frequentie van elk cluster te verkrijgen. Visualiseer ten slotte de expressieintensiteit van de CD45-, CD11c- en CD54-markeringen door de noterende merknamen en voeg deze op in de MSI-plotfunctie. Cytofast voert verschillende mogelijke uitgangen uit, waaronder de heatmap van alle clusters die in de analyse zijn geïdentificeerd en op basis van markeringsexpressie.

Het dendrogram aan de bovenkant vertegenwoordigt de hiërarchische gelijkenis tussen de geïdentificeerde clusters. Het bovenste paneel toont een andere warmtekaart met de relatieve hoeveelheid overeenkomstige subsets in elk monster. Ondertussen toont het dendrogram aan de rechterkant de gelijkenis tussen monsters op basis van subsetfrequenties waaruit blijkt dat het fenotype van natuurlijke killer cellen wordt gevormd door PD-L1 behandeling drie dagen na injectie.

De gecombineerde warmtekaarten zijn te verkrijgen voor FlowSOM gevolgd door Cytofast en voor Cytosplore gevolgd door Cytofast. Cytofast kan ook worden gebruikt om de gegevens kwantitatief te presenteren en de resultaten weer te geven in box plots. Een andere functie die is opgenomen in het Cytofast-pakket is de MSI-plotfunctie die de mediane signaalintensiteit van elke marker per groep weergeeft.

Deze functie maakt detectie van globale veranderingen mogelijk, zoals toename van de expressie van CD54 of CD11c in natuurlijke killercellen van de PD-L1 behandelde groep. Deze techniek is een snelle manier om gegevens te visualiseren en te kwantificeren en kan worden gebruikt om nieuwe cellulaire reacties na de therapie te ontdekken. Na deze methode kan het globale testpakket in R worden gebruikt om een groep covariaten te testen op associatie met responsvariabelen.

Dit toont de correlatie tussen elke subsets en de klinische uitkomst.