High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

Deze methode kan belangrijke vragen in het transcriptieregulatieveld beantwoorden, zoals de rol van chromatineinteracties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een relatief onbevooroordeelde vangst van de interacties voor een locus van belang biedt. Hoewel deze methode inzicht kan geven in interacties tussen promotorversterker, kan deze ook worden toegepast om andere soorten chromatineinteracties te identificeren.

Over het algemeen, individuen nieuw op deze methode zal worstelen, omdat het duurt enkele dagen voor het protocol, en de primer ontwerp vereist trial and error en atypische primer oriëntatie. Om chromatine interacties in cellen van keuze te behouden, kruis ze door ze toe te voegen door 9,5 milliliter van 1% elektronenmicroscopie grade formaldehyde toe te voegen in PBS per 10 miljoen cellen. Incubeer de cellen tijdens het schommelen gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.

Breng de reactiebuizen over op ijs om de kruiskoppelingsreactie te doven en voeg ijskoude een molar glycine toe aan een laatste concentratie van 0,125 molar en meng door zachte inversie. Na het centrifugeren en wassen van de cellen volgens het tekstprotocol, opnieuw opschorten de pellet in 125 microliters van vijf millimolar EDTA met 0,5% SDS en een X proteaseremmers. De celopening op ijs gedurende 10 minuten uitbroeden.

Om ervoor te zorgen dat de cel lyse is voltooid, meng zes microliter van de cellen met zes microliter van trypan blauw op een microscoop dia en bedek met een cover slip. Bekijk onder een microscoop het interieur van de gelyseerde cellen blauw, en ongelyseerde cellen wit. Voor de eerste beperking vergisting voeg 30 microliter van 10 X beperking enzym buffer, en 27 microliter van 20%Triton X-100 aan de cel suspensie en het totale volume aan te passen tot 300 microliter met water.

Verwijder een 15 microliter aliquot en bewaar op vier graden Celsius als onverteerd controle. Aan het resterende reactiemengsel voeg 200 verenigt van beperkingsenzym één. Incubeer 's nachts bij de temperatuur geschikt voor het enzym in een schudden verwarming blok met 900 RPM agitatie.

De volgende dag, voeg een extra 200 eenheden van het enzym en zet deze incubatie 's nachts. Verwijder een 15 microliter aliquot en bewaar op vier graden Celsius als verteerd controle. Om de efficiëntie van de spijsvertering te bepalen, voegt u 82,5 microliter van 10 millimolar Tris-HCl, pH 7.5, toe aan elke onverteerde en verteerde regelaar.

Voeg 2,5 microliter proteinase K toe en broed gedurende een uur bij 65 graden Celsius om de formaldehydekruisverbinding om te keren. Om het verteerde DNA te isoleren, voeg 100 microliters fenolchloroform toe aan de buis. Meng door verschillende snelle inversies om restwitverontreiniging te verwijderen.

Centrifuge op 16, 100 G's bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Breng na centrifugatie de waterige fase over op een nieuwe buis. Voeg natriumacetaat, glycogeen en 100% ethanol toe aan de buis en meng voorzichtig door inversie.

Incubeer bij min 80 graden Celsius gedurende een uur om het DNA te laten neerslaan. Centrifuge de buis op 16, 100 G's op vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Verwijder de supernatant, en voeg vervolgens 500 microliters van 70% ethanol om de DNA-pellet te wassen.

Centrifuge op 16, 100 G's bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Na het verwijderen van de supernatant lucht droog de pellet op kamertemperatuur gedurende twee minuten om resterende ethanol te verwijderen. Stel de gedroogde pellet opnieuw op in 50 microliters nucleasevrij water en ga verder met het bepalen van de spijsverteringsefficiëntie door QPCR zoals beschreven in het tekstprotocol.

Om voor te bereiden op ligatie, verwarm en activeer het beperkingsenzym door de buis gedurende 20 minuten uit te broeden bij 65 graden Celsius. Breng vervolgens de inhoud van de buis over op een conische buis van 50 milliliter en voeg nucleasevrij water, 10 X ligase buffer en T4 DNA-ligase toe. Meng zachtjes door te wervelen, en broeden 's nachts op 16 graden Celsius en ga zoals beschreven in het tekstprotocol.

Om cross linking te keren voeg 15 microliter proteinase K en incubeer 's nachts bij 65 graden Celsius. Op de volgende dag voeg 30 microliter van RNase A, en incubeer op 45 minuten bij 37 graden Celsius. Om verder te gaan met chromatine isolatie, voeg zeven milliliter fenol chloroform en meng door verschillende snelle inversies.

Centrifuge de buis op 3, 300 G's bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Breng na centrifugatie de waterige fase over naar een nieuwe buis van 50 milliliter en voeg nucleasevrij water, drie molar natriumacetaat, glycogeen en 100% ethanol toe. Meng de inhoud en incubeer bij negatieve 80 graden Celsius gedurende een uur.

Na incubatie, centrifugeren de buis op 3, 900 G's op vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Verwijder de supernatant, en dan was de pellet met 10 milliliter ijskoud 70%ethanol. Centrifuge op 3, 300 G's bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten.

Verwijder de supernatant en droog de pellet kort op kamertemperatuur. Los de pellet op in 150 microliter van 10 millimolar Tris-HCl pH 7,5 bij 37 graden Celsius. Bewaar bij negatieve 20 graden Celsius of ga verder met de tweede beperking spijsvertering, ligatie, en DNA-zuivering zoals beschreven in het tekstprotocol.

Na DNA-zuivering, uit te voeren QPCR met behulp van omgekeerde PCR primers en cyber en ROX kleurstoffen om het aantal versterking cycli voor omgekeerde PCR versterking van onbekende interactie sequenties zoals beschreven in de tekst te bepalen. Om DNA voor te bereiden op sequencing, trim off aas sequenties met derde beperking spijsvertering door het verteren van een microgram gezuiverd product van omgekeerde PCR evenals beperking enzym monitor. Voer de verteerde beperking enzym, of RE monitor, op een agarose gel van een concentratie geschikt voor de verwachte fragmenten.

Zodra de efficiëntie van de spijsvertering is bepaald door gel elektroforese, doorgaan met omgekeerde PCR productzuivering en voorbereiding van sequencing bibliotheek, zoals beschreven in het tekstprotocol. Derde beperking spijsvertering is belangrijk in dit protocol voor de volgende generatie sequencing van circulaire chromosoom bevestiging vastleggen. Deze spijsvertering trimt aas sequenties die de identificatie van chromatine attracties kan vergemakkelijken.

Agarose gel elektroforese van verteerde RE monitor wees op voldoende vertering van het inverse PCR product dat parallel wordt verteerd. Na het voltooide werden vier C sequencing reads bijgesneden en in kaart gebracht aan het menselijk referentiegenoom hg38, met behulp van BWA softwarepakket. De meerderheid van de leest uitlijnen op beperking sites HindiIII of CviQ1I sites grenzend aan HindiIII sites zoals verwacht.

Tijdens het proberen van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat uw cellen zijn lysed en de chromatine is voldoende verteerd. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals chromatineimmunatie of CHIP, om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het identificeren van transcriptiefactoren die betrokken zijn bij de chromatineinteracties. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op chromatinegebied om fysieke regelgevende netwerken te verkennen.