Gebruik van High-Throughput geautomatiseerd Microbioreactor-systeem voor de productie van Model IgG1 in CHO cellen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van enkele van de belangrijke vragen op het gebied van Bio proces productie met betrekking tot aspecten van cellijn karakterisering en bemiddelen en procesoptimalisatie. Voordelen van deze techniek zijn dat het meer controle biedt in schudkolven en automatisering en de prestaties van grote aantallen kleinschalige studies voor snelle gegevensgeneratie mogelijk maakt. Het demonstreren van de procedure zal zijn, Sai Rashmika Velugula en Casey Kohnhorst, research fellows in mijn laboratorium.

Begin met het onderdompelen van een voorraad verachtelijke van drie keer 10 tot de zevende show cellen per milliliter van bevriezing medium in een 37 graden Celsius waterbad. Wanneer slechts een klein stukje ijs overblijft, zachtjes pipet de snel ontdooide cel suspensie een paar keer en breng een milliliter cellen in een steriele 125 milliliter geventileerde shake kolf met 29 milliliter van OptiCHO medium. Plaats de kolf in een celcultuur incubator op 37 graden Celsius en 8% CO2 met schudden 130 RPM.

Subculturing van de cellen na 72 uur in 100 milliliter van verse 37 graden Celsius medium in een 125 milliliter spinner fles voor nog eens 72 uur incubatie bij 37 graden Celsius en 8% CO2 met roeren bij 70 RPM. Op de derde dag van de subcultuur, voeg vers voorverwarmd medium aan de spinnerkolf om de cellen te handhaven op een ten minste 90%levensvatbaarheid voor een laatste 24 uur cultuur. De volgende ochtend klikt u op het pictogram voor extern bureaublad en klikt u op verbinding maken.

Wanneer het externe bureaublad is aangesloten, opent u de software van de celteller en installeert u een nieuw Reagent Pak. Leeg vervolgens het Trypan Blue-afval en maak het systeem klaar. Minimaliseer vervolgens de externe verbinding en open de software voor microbioreactoren met behulp van een bestaand experiment als sjabloon om een nieuw experiment te maken.

Definieer voor het starten van een run de platen die tijdens de run in de nabootsingssectie van de software worden gebruikt en plaats 12 steriele kweekvaten in elk kweekstation. Plaats autoclaved klem platen op de top van de vaten en plaats de roerplaten op de top van de klem platen ervoor te zorgen dat elke pin stevig wordt geplaatst. Zet vervolgens de klemplaten vast met de meegeleverde schroeven en nobs.

Om het systeem op te starten scan je de barcode die bij elk kweekschip wordt geleverd. Het systeem zal de aanwezigheid van de juiste vaartuigen initialiseren en controleren. Stel de temperatuurregeling in op 37 graden Celsius en het roeren op 1.000 RPM en zet de opgeloste zuurstof PH-monitor aan.

Voer vervolgens het medium oplaadprogramma uit. Wanneer al het medium is geladen, worden 35 microliter EX-CELL Antifoam toegevoegd van de Antifoamplaat aan de kweekvaten. Na 30 minuten beginnen met het opnemen van de opgeloste zuurstof en PH binnen de kweekmedia, waardoor de opgeloste zuurstof een setpoint van 50% bereikt Na het opgeloste zuurstofevenwicht, schakel je de toevoegingen van de achtergrondbasis in om een PH-setpoint van 7.1 te bereiken voor alle kweekvaten.

De volgende ochtend voert u de onderbroken PH-stap uit en brengt u de volledige inhoud van de spinnerkolf over in een steriele conische buis van 250 milliliter voor centrifugatie. Resuspend de pellet in voldoende vers medium dat de uiteindelijke dichtheid zal een keer 10 tot de zesde CHO cellen per milliliter na het toevoegen van de entmateriaal aan de kweekvaten en voeg de zwevende cellen in de juiste putten van een steriele deksel 24 put plaat. Voeg drie milliliter inoculum aan elke put en plaats de entmateriaal plaat op de aangewezen bureau in de kap.

Laat vervolgens de kweekschepen minstens een uur in evenwicht komen en start de vijf EX-CELL-tellingstap in het programma. Voor dagelijkse nutriënten- en metabolietanalyse op dag twee worden de platen van de monsterbuishouder op de aangewezen dekken geplaatst en open microcentrifugebuizen in de juiste houders geladen. Plaats vervolgens de monsters in de analyzerlade om de voedingsanalyse uit te voeren.

Als u de run wilt beëindigen, schakelt u eerst de temperatuurregeling uit, gevolgd door de agitatie. Stop de opgeloste zuurstof PH-controle en achtergrondbasis toevoegingen, alle andere controles, en het systeem monitor. Schroef de klem en roerplaten los, verwijder de kweekvaten en schroef de droogplaten in het kweekstation.

Voer vervolgens de droogcyclus van twee uur uit op het programma;klik op stop in de bioreactorsoftware zodra de droogcyclus is voltooid. Om de cellen te oogsten brengen ze de celkweekvloeistof uit de reactorvaten over in overeenkomstige conische buizen voor centrifugatie en filteren ze de supernatants door steriele 0,22 micrometer PVDH-filters. Breng vervolgens een milliliter van elke steriele celcultuur supernatant over in individuele 1,5 milliliter microcentrifugebuizen voor negatieve opslag van 20 graden Celsius tot titeranalyse.

Om de IgG-titers van de monsters te meten, schakelt u eerst het biosensorsysteem voor eiwithulp in. Nadat de lamp ten minste een uur is opgewarmd, laat u de monsters minstens 30 minuten in evenwicht brengen met kamertemperatuur en één eiwitsteunpunt per monster in vers celmedium vooraf. Stel vervolgens de temperatuur van de plaat in op 26 graden Celsius.

Laad de monsters in het systeem en voer de test uit met behulp van de standaard gevoeligheidstest met regeneratie in de software voor gegevensverwerving. Met behulp van de geïntegreerde celteller kunnen de gemiddelde levensvatbare celdichtheden en viabilities dagelijks worden verkregen voor alle cultuuromstandigheden. Met behulp van de nutriënten analyzer kunnen we ook de voedings- en bijproductprofielen verkrijgen die de haalbaarheid aantonen van het monitoren van deze eigenschappen in het microbioreactorsysteem.

Verder kan de totale productiviteit van de celculturen onder de verschillende cultuuromstandigheden van belang worden gekwantificeerd met behulp van het eiwithulpbiosensorsysteem zoals aangetoond. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat het protocol alleen werkt als de programmering correct wordt uitgevoerd; zorgen voor tijdige uitvoering van protocolstappen met minimale fouten. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals:vloeibare chromatografie, massaspectrometrie en multi-angle lichtverstrooiing worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot de fysische en chemische eigenschappen van het vervaardigde product.