Morfometrische Protocol voor de objectieve beoordeling van de Blastocyst gedrag tijdens verglazing en opwarming van de aarde stappen

Dit morfometrische protocol maakt het mogelijk om de intensiteit van blastocystkrimp en heruitbreiding tijdens eerdere vitrificatieinterventies en naopwarmingsherstel te monitoren en geeft inzicht in de effectiviteit van virus vitrificatiemethoden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan worden toegepast op in vitro fertilisatielaboratoria uitgerust met time-lapse microscopen en computers met geavanceerde beeldbewerkingssoftware. Op dag vijf of zes van de expansie, onderwerp een blastocyst met ten minste een paar binnenste cel massacellen en een samenhangendtrophectoderm tot een 0,4 tot 0,7 milliseconde laserpuls met een gat diameter variërend van 4,3 tot 9,4 micrometer tangentially gericht op de zona pellucida en de kruising van twee aangrenzende trophectodermal cellen.

Laat de blastocoel vervolgens gedurende vijf minuten geheel of gedeeltelijk instorten. Gebruik vervolgens een kleine pipet om aseptisch toe te voegen evenwicht medium in de gaten van de microdroplet gebied van een negen-well petrischaal, speciaal ontworpen voor time-lapse microscopie en opname. Wanneer alle van het medium is toegevoegd, overlay het microdruppelgebied met ongeveer 30 microliter van evenwicht medium.

En dompel de laserbehandelde blastocyst onder in het evenwichtsmedium in de bodem van een microdruppelput van de microdruppelschotel. Zodra de blastocyst is overgedragen, start u een countdown timer voor 10 minuten. En breng de microdroplet schotel op het podium van een camera uitgeruste microscoop.

Met behulp van een vergroting van 200 X past u de microdropletschotel zo aan dat de blastocyst zich in ongeveer het midden van het opnamevenster bevindt. Begin vervolgens met opnemen met de microscoopopnamesoftware, waarbij de afteltijd waarop de opname wordt gestart, wordt opgeteld. Om de blastocyst op te slaan, na het laden van het embryo in een vitrification stro, verzegel het stro, en dompel het stro in vloeibare stikstof tussen 80 tot 110 seconden van het laden, alvorens de blastocyst bij negatieve 196 graden Van Celsius.

Als u het doorsnedegebied van de bewaakte blastocyst tijdens de evenwichtsfase wilt meten, plaatst u de markering van het snelle selectiegereedschap in de blastocyst totdat deze de rand van de blastocyst raakt en klikt u herhaaldelijk op de linkermuisknop om de buitenste rand van de blastocyst te schetsen totdat het volledige dwarsdoorsnedegebied van de blastocyst is geselecteerd. Klik vervolgens in het tijdlijnvenster op het meetlogboek en noteert metingen. Voor blastocyst re-expansie, snel overbrengen van de HSV stro met de verglaasde blastocyst van opslag naar een vloeibare stikstof gevulde draagbare reservoir.

En gebruik tangen om het stro net hoog genoeg op te tillen om de gekleurde handling staaf bloot te leggen. Gebruik een zelfstellende draadstripper om het stro te snijden op de hoogte van de gekleurde handling staaf. En haal de helingstaaf uit het stro met een snelle gecontroleerde beweging.

Duik onmiddellijk de gebogen spatel van de handling staaf in een container van 37 graden Celsius ontdooiende oplossing. En draai voorzichtig de heilsstaaf om de blastocyst los te maken. Na een minuut, was de blastocyst met sequentiële vier minuten onderdompee en verdunning oplossing.

Wasoplossing één, en wasoplossing twee. Breng vervolgens de opgewarmde blastocyst over in een vier putschotel met vers herstelmedium en gebruik een pipet om de blastocyst in alle drie de druppels medium te wassen. Breng na de laatste wasbeurt de blastocyst over naar een negen goed time-lapse schotel, met herstelmedium.

En plaats de negen put schotel onder een time-lapse camera in een 37 graden Celsius, 6% CO2 en 5% O2 incubator. Open nu de time-lapse opnamesoftware en selecteer een opnamecamera. Selecteer de live-modus en plaats de cursor op de afbeelding.

Schuif om de afbeelding te vergroten en gebruik de linkermuisknop om de put met de blastocyst in het midden van het scherm te positioneren. Gebruik onder scherpstellen de pijlen om het opnamevlak van de blastocyst scherp te stellen en onder lichtintensiteit de lichtintensiteit van het beeld in te stellen. Klik op microscoopparameters om de belichtingstijd en gamma in te stellen en klik op de live-modus sluiten.

Klik op project starten om de projectgegevens in te voeren. Selecteer het type kweekschotel en schakel alle posities uit, behalve de te registreren posities. Stel vervolgens de opnametijd in om elke vijf minuten een foto te maken en klik op goedkeuren om de blastocyst re-uitbreiding gedurende ten minste 150 minuten op te nemen.

In deze representatieve, continu gecontroleerde, intacte embryo, de intacte blastocyst niet volledig instorten in de evenwichtsoplossing en opnieuw uitgebreid tot ongeveer 70% van de oorspronkelijke grootte, na 10 minuten van blootstelling aan evenwicht oplossing. In tegenstelling, deze kunstmatig ingestorte blastocyst werd volledig geleegd van de blastocoel onmiddellijk na laserbehandeling en geen significante re-expansie werd waargenomen tijdens de 10 minuten van blootstelling aan evenwichtsoplossing. Na behandeling met vitrification medium, met een hoge concentratie cryoprotectiva, onderging deze geëquilibreerde intacte blastocyst een stapsgewijze vermindering van de blastocoel.

Na de opwarming, het opnieuw uitgebreid na blootstelling aan herstel medium. Deze lasergepulseerde blastocyst echter, toonde een onmiddellijke ineenstorting van de blastocoel bij behandeling met de laser, die niet werd hersteld tijdens de equilibratie of vitrification stappen, waardoor de noodzaak van een dergelijke lange evenwichtsfase voor ingestorte blastocysten in twijfel werd getrokken. Het protocol geeft ook inzicht in het vermogen van blastocysten om blastocoel te herstellen na opwarming.

Bijvoorbeeld, blastocoel re-expansie na opwarming kan lineair zijn, of kan worden onderbroken met meerdere grotere of kleinere contracties. Tijdens het proberen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de embryo's moeten blijven op de bodem van de petrischaal tijdens de opname, voor zo weinig mogelijk tijd. Vergeet niet dat hoge concentraties cryoprotectiva giftig kunnen zijn voor embryo's.

Na elke ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van cryobiologie, om de effectiviteit van cryopreservatieprotocollen in een in vitro bevruchtingsprogramma te onderzoeken.