Een Fluorogenic Peptide decollete Assay aan het scherm voor Proteolytic activiteit: toepassingen voor coronavirus spike eiwit activering

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van biochemie, zoals de proteolytische modificatie van eiwitten, evenals de karakterisering van remmers en proteases en peptidases. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een snelle screening van de proteolytische activiteit van proteasen op peptiden mogelijk maakt, die de decolletékant van het gegeven eiwit vertegenwoordigen. Het gebruik hier is om proteases te bestuderen die virale fusie activeren.

De eerste stap in peptide ontwerp is het verwerven van de volgorde van de fusie-eiwit van belang uit een openbare database zoals NCBI of het virus pathogen database. Kies de protease herkenningsplaats die het fusiepeptidemiddel voortgaat en voeg twee tot drie aminozuren stroomopwaarts en stroomafwaarts van deze sequentie toe. Bij het bestellen van het peptide, wijzigen met de fluorescentie resonantie energieoverdracht of FRET paar, Mca aan het eindeinde eindpunt en Dnp op het c eindpunt.

Tijdens de test, Mca is opgewonden en zendt lichtenergie die wordt geblust door Dnp, zolang het paar is in de nabijheid van elkaar. Echter, als decolleté optreedt, zal Dnp niet in staat zijn om de emissie die vervolgens kan worden gelezen door de fluorescentie plaatlezer te blussen. Resuspend de peptide volgens de aanbevelingen van de fabrikanten door zachtjes pipetteren op en neer.

Bijvoorbeeld, resuspend in 70%ethanol tot een laatste concentratie van een millimolar. Als het peptide niet erg goed wordt opgespen door pipet, plaatst u de buis met het peptide en het oplosmiddel in een sonicatiebad totdat het volledig opnieuw wordt opgespen. Doe 100 microliter aliquots van het peptide in lichtdempende of resistente buizen om het peptide te beschermen tegen bleken.

Bewaar de aliquots op min 20 graden Celsius. Begin deze procedure door het inschakelen van de plaatlezer en wachten tot de zelftest is voltooid. Open vervolgens de bedrijfssoftware op de aangesloten computer en zorg ervoor dat deze is verbonden met de plaatlezer.

Open de temperatuurinstelling en stel deze in op de gewenste temperatuur voor optimale prestaties voor de protease, die in dit geval 30 graden Celsius is. Als u het experiment wilt instellen, klikt u op de configuratie van het controle-instrument, kiest u kinetisch en selecteert u fluorescentie. Voer een excitatiegolflengte van 330 nanometer en een emissiegolflengte van 390 nanometer in.

Schakel de automatische cut-off uit en selecteer medium/normale gevoeligheid. Kies een looptijd van een uur voor de test en selecteer elke 60 seconden één meting. Stel vijf seconden van het mengen voor de eerste meting, en drie seconden voor elke meting.

Selecteer ten slotte de putten om te lezen. Bereid de juiste testbuffers voor de proteasen zoals beschreven in het tekstprotocol en koel de buffers op ijs. Plaats een effen zwarte polystyreen niet-behandelde platte bodem 96-put plaat op ijs met een dunne metalen plaat eronder ter ondersteuning van koeling en stabiliteit.

Het is essentieel om een zwarte plaat als testplaat te gebruiken, om fluorescerende lekkage uit aangrenzende putten te voorkomen. Bereid per peptide drie technische replicaties per test en een totaal volume van 100 microliter per monster voor. Pipette de juiste hoeveelheid testbuffer in elke put van de testplaat.

Voeg 0,5 microliter protease toe aan elke put. Voeg aan zes putten 0,5 microliter buffer toe in plaats van de respectievelijke protease. Drie van deze zullen worden blinde controles en de andere drie zal peptide controles.

Voeg vijf microliter van het peptide toe aan een uiteindelijke concentratie van 50 micromolar aan elke put, behalve de blinde bedieningselementen. Voeg aan elk van de drie blinde controleputten vijf microliters buffer toe in plaats van peptide. Steek de plaat in de bloemescenten plaatlezer en klik op start.

Voordat u met de gegevensanalyse begint, slaat u het experimentbestand op. Klik op exporteren en exporteer het bestand als txt. Importeer het txt-bestand in een spreadsheet.

Start de analyse door een grafiek te maken en de relatieve tl-eenheden op de y-as in kaart te brengen tegen de tijd op de x-as voor elke technische replica per monster. Selecteer het gegevensbereik waar de grafiek zich in een lineair bereik bevindt en het dichtst bij het begin van de fluorescentietoename. Plot de geselecteerde gegevens op een tweede grafiek en voeg een lineaire trendlijn toe.

Selecteer in de opties voor de trendlijn de weergavevergelijking op de grafiek. De vergelijking toont V max, die overeenkomt met de helling van de trendlijn. Bereken de gemiddelde V max voor elk monster uit de drie technische replica's.

Na het herhalen van het experiment nog twee keer, om drie biologische replicaties te verkrijgen, bereken de standaarddeviatie op basis van de gegevens van de drie onafhankelijke biologische replica's. Een furin decolletétest van het menselijk MERS coronavirus, EMC/2012 S2 prime site, en camel-derived double-mutant stam HKU205, samen met enkele mutant varianten van EMC/2012 bleek dat de EMC/2012 peptide was efficiënt decollete, terwijl bijna geen decolleté van de S2 prime peptide van HKU205 opgetreden. Decolleté van het EMC/2012 A-S gemuteerd S2 prime peptide werd sterk verminderd, en er was bijna geen decolleté van de EMC/2012 S naar I gemuteerd S2 prime peptide.

Een andere furin decolleté test toonde slechts minimale decolleté van de kameel-afgeleide Marokko 213 S2 prime site, in vergelijking met de menselijke MERS coronavirus, EMC/2012 S2 prime site. Furin decolleté werd waargenomen voor het prototypische S1/S2 peptide, FECV I en 4 S1/S2, maar niet in het gemuteerde S1/S2 peptide, FIPV I Black S1/S2. Op dezelfde manier was furin in staat om de prototypische S2 prime peptide, FECV II 1683 S2 prime, maar niet de gemuteerde S2 prime peptiden, FECV I en 4 S2 prime, FIPV I Black S2 prime, en FIPV II 1146 S2 prime.

Na deze procedure, westerse vlek analyse of amino-fluorescentie testen, met behulp van de volledige lengte eiwit van belang kan worden uitgevoerd om eiwit decolleté te verifiëren, of in dit geval, als decolleté resulteert in een fusogene versie van de virale fusie-eiwit.