Productie van Pseudotyped deeltjes te bestuderen van hoogpathogene Coronaviruses in een omgeving van bioveiligheid niveau 2

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om pseudotypevirussen te genereren die veilig kunnen worden gebruikt om virale instapgebeurtenissen van hoogpathogene virussen te bestuderen, zoals sal coronavirus en de meeste coronavirus. Deze veelzijdige techniek is gebaseerd op de eenvoudige setup tijdelijke transfectie. Dit systeem kan ook worden toegepast op deeltjes pseudotyped met fusie-eiwitten van andere virussen te produceren, niet alleen coronavirus S.Voor de beste resultaten is het belangrijk om de gezondheid van cellen en dichtheid te controleren voor transfectie en voor pseudotype virusinfectie.

Het aantonen van deze procedure zal Tiffany Tang, en Lakshmi Nathan. Afgestudeerde studenten van mijn laboratorium. Om te beginnen, zorgvuldig wassen HEK293T cellen met 10 milliliter van 37 graden Celsius, voorverwarmde DPBS tweemaal.

Vervolgens, aspirate de supernatant en bevestig cellen met een milliliter van 25%trypsine oplossing die is voorverwarmd op 37 graden Celsius. Dan, incubeer de kolf van cellen op 37 graden Celsius in 5% kooldioxide milieu gedurende drie tot vijf minuten totdat cellen beginnen los te maken. Voeg vier milliliter complete DMEM toe om de trypsineoplossing te deactiveren.

En dan cellen tellen met behulp van een cel tellen dia en een lichtmicroscoop. Verdun cellen tot 500.000 cellen per milliliter met volledige DMEM. Vervolgens zaad twee milliliter per put van de celoplossing in een 6-well weefsel kweekplaat.

En beweeg de plaat voorzichtig heen en weer en van links naar rechts om cellen gelijkmatig te verdelen. Na ervoor te zorgen dat cellen gelijkmatig worden verdeeld incubeer de plaat op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide milieu 's nachts of 16 tot 18 uur. Om drie plasmide cotransfectie voor te vormen, meng je eerst berekende hoeveelheden plasmiden en het verlaagde serumcelkweekmedium in een microcentrifugebuis.

Broed het mengsel vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens drie microliters per put van het op lipide gebaseerde transfectiereagensagemiddel toe aan 47 microliter per put van het verlaagde serumcelkweekmedium. Broed het mengsel vijf minuten op kamertemperatuur.

Meng vervolgens in een microcentrifugebuis gelijke hoeveelheden van het transfectiereagens en de plasmideoplossingen door een pijp meerdere keren op en neer te laten gaan. Incubeer het mengsel op kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Na nachtelijke incubatie van de celplaat, gebruik een omgekeerde lichtmicroscoop om cellen te onderzoeken op hun morfologie en dichtheid.

Dan, aspirate het gebruikte medium van cellen en voeg voorzichtig een milliliter per put van de voorverwarmde verminderde serum cel cultuur medium aan elke put. Voeg vervolgens 100 microliters van de transfectieoplossing toe aan elke putdrop wise. En de cellen uitbroeden bij 37 graden Celsius in 5% kooldioxide gedurende vier tot zes uur.

Voeg aan het einde van de incubatie een milliliter voorverwarmde antibioticavrije transfectie DMEM toe, bij 37 graden Celsius aan elke put. En de cellen incubeer maken op 37 graden Celsius in 5% kooldioxide gedurende 48 uur. Om te beginnen pseudotype deeltjes collectie gebruik maken van een omgekeerde lichtmicroscoop om de cellen examen voor hun morfologie en algemene conditie.

De kleur van het medium moet lichtroze of licht oranje zijn. Breng vervolgens de supernatanten van de transfected cellen over naar 50 milliliter conische centrifugebuizen. Centrifuge de buizen op 290 keer zwaartekracht gedurende zeven minuten om celpuin te verwijderen.

Vervolgens filter verduidelijkt supernatant door middel van een steriele 0,45 micron porie grootte filter. Maak kleine hoeveelheden aliquots van pseudotype virus oplossing in cryo flesjes. En bewaar ze op negatieve 80 graden Celsius.

Om pseudotyped deeltjesbesmetting uit te voeren, eerste examencellen onder lichte microscoop om te bevestigen dat er een samenvloeid tapijt van cellen is. Was vervolgens de cellen drie keer met 0,5 milliliter van het voorverwarmde DPBS bij 37 graden Celsius. Vervolgens, aspirate de supernatants van cellen en inenten de cellen met 200 microliters van de ontdooide pseudotyped deeltjes oplossing.

Incubeer de cellen op 37 graden Celsius in 5%kooldioxide gedurende een tot twee uur. Voeg na de incubatietijd 300 microliter van het voorverwarmde DMEMc toe bij 37 graden Celsius. En de geïnfecteerde cellen in te broeden op 37 graden Celsius in 5% kooldioxide gedurende 72 uur.

Tot slot de supernatants van de geïnfecteerde cellen aanzuigen. En voorafgaan aan luciferase reporter test. Om de infectiviteit van pseudo-getypte deeltjes eerst te ontdooien luciferin substraat, opgeslagen bij min 80 graden Celsius, op vijf keer luciferase assay lysis buffer opgeslagen bij min 20 graden Celsius tot kamertemperatuur.

Verdun vervolgens de luciferase assay lysis buffer tot een keer concentratie met steriel water. Voeg vervolgens 100 microliter van de verdunde buffer toe aan elke put. En incubeer bij kamertemperatuur op een rocker gedurende 15 minuten.

Om luciferase activiteit meting uit te voeren, een goed per keer, eerst 20 microliter luciferine substraat toe te voegen aan een microcentrifuge buis. Voeg vervolgens 10 microliter van het lysaat toe aan de buis. Meng de inhoud door de buizen voorzichtig te bewegen.

En plaatste de buis in een luminometer apparaat. Sluit het deksel en meet de luminescentiewaarde van de buis. Nota van de relatieve lichteenheden meting, en voorafgaan aan gegevensanalyse.

Infectiviteitstesten van SARS-Spp en MERS-Spp in gevoelige gastheercellen, toonden een sterke gemiddelde infectiviteit, vergeleken met de verwachte positieve controledeeltjes. Niet-geïnfecteerde controles en de negatieve controle deeltjes ontbreekt virale envelop glycoproteins. Ook luciferase activiteit testen toonde concentratie afhankelijkheid van SARS-Spp en MERS-Spp infectiviteit.

Een toename van SARS-Spp of MERS-Spp infectiviteit in slecht tolerante doelcellen, overtransfected om ACE2 receptor van SARS-Spp, of DPP4 receptor van MERS-Spp, uit te drukken, bevestigt dat receptorgebruik vanvirionen vergelijkbaar is met dat van navo-virussen voor bemiddelende gehechtheid en binnenkomst van pseudovirions. Controleer de berekeningen voordat u deze stap uitvoert. En zorg ervoor dat alle oplossingen goed worden gemengd tijdens de stap.

Een westerse vlektest kan worden uitgevoerd op geconcentreerde pseudotyped deeltjes om S glycoproteïne-integratie in de pseudovirions te beoordelen. Hoewel de hier beschreven gepseufde deeltjes veiliger zijn dan navo-virussen, vereisen ze nog steeds bioveiligheidsniveau twee voorzorgsmaatregelen.