Visualisering van lymfeklieren structuur en cellulaire lokalisatie met behulp van ex-vivo confocale microscopie

Dit reproduceerbare en eenvoudig uit te voeren protocol maakt gebruik van een ex-vivo lymfeklierbeeldvormingsstrategie om het afta-afvoeren van in-vivo toegediende fluorescerende gelabelde antilichamen tegen lokale secundaire lymfoïdeorganen bij te houden. Het aantonen van deze techniek maakt een specifieke visualisatie van de procedure mogelijk, die een succesvolle uitvoering van het protocol kan vergemakkelijken. Dit is een zeer eenvoudige en eenvoudige techniek die kan worden uitgevoerd door iedereen.

Het enige uitdagende aspect is de muis behandeling, die enige training vereist. Deze techniek heeft het voordeel van een verbeterde snelheid weefsel inspanning behoud en cel levensvatbaarheid in vergelijking met de conventionele fluorescerende kleuring methoden. De opleiding van de procedure zou Bruna Tatematsu, een technicus van het laboratorium zijn.

Verdun de antilichamen van belang, geconjugeerd aan de juiste fluoroforen, in 100 microliter van PBS voor inguinale lymfeklierbeeldvorming, of 50 microliter pbs voor popliteale lymfeklierbeeldvorming. Voor inguinale lymfeklier beeldvorming, laad 100 microliter van de antilichaam cocktail in een een milliliter insulinespuit, uitgerust met een 30 meter door halve inch naald, en onderhuids injecteren van de antilichamen in de binnenkant dij van de experimentele muis. Voor popliteale lymfeklierbeeldvorming, injecteer 50 microliter van de antilichaamcocktail onderhuids in één pootpad van het experimentele dier.

Breng het dier dan terug naar zijn thuisbox. Voor inguinale drainerende lymfeklier oogst, na het wachten ten minste drie uur na de injectie, immobiliseren van de muis op de acryl stadium met plakband en minerale olie toe te passen op de buikhuid. Gebruik standaard microchirurg schaar en microchirurg gebogen tangen om een midline huid incisie in de buik te maken van de schaamstreek naar de xyphoid proces, en dissociaal de buikspierculatuur van de huid.

Maak horizontale huidinsnijdingen in de boven- en onderkant van de verticale incisielijn, om huidflappen aan de zijkant van de injectie te creëren en trek de huid in om de lymfeklier te visualiseren. Zet de huidflap vast aan de acrylplaat en gebruik de tangen om de doorschijnende, meestal bilobulaire bolvormige inguinale drainerende lymfeklier te verwijderen. Voor popliteal drainerende lymfeklieroogst, ten minste 12 uur na de injectie, immobiliseer de muis in de gevoelige positie op een acrylstadium.

Breng minerale olie aan op het kalf en de knie aan de geïnjecteerde kant van het dier. Maak vervolgens een middellijn incisie in het kalf van de hiel tot de knie, en dissociate het kalf spierstelsel van de huid. Ontmasker de popliteal fossa.

De popliteale lymfeklier verschijnt als een doorschijnende bol in de fossa. Verwijder vervolgens de lymfeklier met de microchirurgie gebogen tangen. Om de lymfeklier voor te bereiden op beeldvorming, plaats de hele organen in een 35 bij 10 millimeter kweekschotel met een glazen bodem en gebruik tangen om vet rond het weefsel te verwijderen.

Centreer het orgaan in het midden van de schotel, en bedek het weefsel met een stuk zout-doorweekte delicate taakwisser. Voor ex vivo beeldvorming, plaats de schotel in de omgekeerde confocale microscoop sleuf en gebruik het conventionele licht van de confocale microscoop en de 4-10X doelstelling om de juiste focus te verkrijgen. Verander van de lichtfunctie naar de lasermodus en gebruik een isotoop-gekleurd, niet-gekleurd of niet-fluorescerend monster om de laserkracht aan te passen, te compenseren en te winnen om de automatische fluorescentie en eventuele niet-gespecificeerde kleuring te verwijderen.

Verwerf afbeeldingen onder de 4, 10 en de 20X-doelstellingen gericht op de lymfeklierstructuur en cellulaire distributie en gebruik een definitie van 1024 bij 1024 pixels. Gebruik vervolgens een geschikt softwareprogramma voor beeldanalyse om de kanalen te scheiden, de schaal en kleuren van belang toe te voegen en om de 3D-weergave te reconstrueren. De krachtige combinatie van immunolabeling van lymfekliercellen met anti-CD4 en anti-CD19 antilichamen en confocale beeldvormingsanalyse maakt de lokalisatie van T- en B-cellen binnen de inguinale lymfeklieren mogelijk.

In de popliteale lymfeklieren, zoals in het inguinale weefsel, worden de B-celzakjes omringd door T-celpopulaties, een kenmerk van de lymfeklierstructuur. Zoals waargenomen in deze beelden, fagocyten niet internaliseren de geïnjecteerde antilichamen, wat aangeeft dat de B en T cel vlekken specifiek is. Bovendien geeft een herreconstructie van de etikettering aan dat de T- en B-celkleuring elkaar niet overlappen, wat de specificiteit van de kleuring verder bevestigt.

Monocellulaire cellen worden waargenomen in de inguinale lymfeklier, met inbegrip van de subcapsulaire sinus. Met de meerderheid van de mononucleaire cellen uitdrukken CX3XR1, gevolgd door CCR2 en CXCR31CCR2 dubbele positieve cellen. Hetzelfde patroon van celverdeling en celfenotypes wordt waargenomen in de popliteale lymfeklier.

Beide lymfeklieren vertonen ook donkere gebieden zonder mononucleaire celreceptorexpressie die worden bezet door lymfocyten. Bovendien zijn mononucleaire cellen schaars binnen het binnenste gebied van de lymfeklieren, die geconcentreerd blijven in de buitenste gebieden van het weefsel, wat aangeeft dat deze cellen voornamelijk de lymfekliersindesinus bezetten. Het antilichaammengsel moet precies in het onderhuidse weefsel worden geïnjecteerd voor het lymfestelsel om de antilichamen goed af te voeren op de lymfeklier.

Deze methode kan worden toegepast op de biodistributie van fluorescerende gelabelde geneesmiddelen, en op celtargetingstudies van fluorescerende nanodeeltjes.