Name: Visualisering van lymfeklieren structuur en cellulaire lokalisatie met behulp van ex-vivo confocale microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Leer ex-vivo beeldvorming van lymfeklieren met fluorescerende antilichamen voor immunologisch onderzoek bij muizen. Deze methode behoudt weefselstructuur en celviabiliteit voor gedetailleerde visualisatie van T- en B-cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de NIH (R01 AI43458 naar H.L.W.).

Het protocol werd goedgekeurd door het Permanent Comité voor dieren aan de Harvard Medical School en het Brigham and Women's Hospital, protocol 2016N000230.
1. muizen gebruikt voor het experiment
<ol><li>Gebruik 8 weken oude mannelijke en vrouwelijke muizen op de B6 achtergrond voor het toedienen van de antilichaammix.</li>
	<li>Gebruik CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT muizen om te bepalen of ex vivo hele LN Imaging ook kan worden toegepast op reporter muizen zonder het toedienen van antilichaammix en om de aanwezigheid van mononucleaire cellen te onderzoeken, waaronder antigeen cellen en fagocyten, en hun verdeling in de LN. Opmerking: CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT reporter muizen hebben respectievelijk groene FLUORESCERENDE eiwitten (GFP) en rood FLUORESCERENDE proteïne (RFP) onder de controle van CX3CR1 en CCR2 promotors. Reporter muizen kunnen worden gebruikt met of zonder de injectie van de antilichaammix. Raadpleeg referentie4 voor antilichaammix injectie in een reporter muis. Ga verder naar een operatie als er geen antilichaam geïnjecteerd wordt.</li>
</ol>2. preparaat en injectie met antilichaammix
Opmerking: Voer deze stappen uit op muizen die worden beschreven in stap 1,1.
<ol><li>Verdun 1:10 van Brilliant Violet (BV) 421 anti-CD4 (GK 1.5; 0,2 mg/mL), 1:10 van briljant blauw (BB) 515 anti-CD19 (1D3; 0,2 mg/mL) en 1:20 van phycoerythrin (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/mL) in PBS met het juiste eindvolume om in de binnenste dij te injecteren (om afbeelding inguinale) of in het Paw pad (naar afbeelding popliteal) lymfe. Opmerking: gebruik als isotypes: BV421 Mouse IgG2b, k Isotype-regeling (R35-38; 0,2 mg/mL); PE rat IgG2a, κ Isotype controle (R35-95; 0,2 mg/mL); BB515 rat IgG2a, κ Isotype controle (R35-95; 0,2 mg/mL). Als u het kleurstof antilichaam wijzigt, gebruik dan de juiste Isotype.</li>
	<li>Voorbeeld inguinale LN, Injecteer 100 μL van de antilichaammix subcutaan in de binnenste dij (Figuur 1a). U ook 50 μL subcutaan van antilichaam mengsel injecteren in het Paw pad naar afbeelding popliteale ln (Figuur 2a). Gebruik delicate 1 mL insuline spuiten, (insuline U-100) met de naald van maat 0,30 mm × 13 mm (30 gauge × 1/2 inch). Opmerking: Zorg ervoor dat de injectie voor inguinale LN-kleuring subcutaan is en niet intramusculair (i.m.), aangezien antilichaam mengsel niet goed wordt afgevoerd als i.m. toediening wordt uitgevoerd.</li>
	<li>Niet verdoken dieren voor antilichaam mengen injectie.</li>
	<li>Wacht minimaal 3 uur (inguinale dLN) en 12 h (popliteal dLN) na injectie om de organen te verwijderen.</li>
	<li>Als LN cellabeling niet volledig wordt waargenomen met behulp van grote polymeer fluorescerende kleurstoffen zoals Brilliant Violet of Brilliant Blue, gebruik dan kleinere fluor Foren, waaronder fluoresceïne isothiocyanaat (FITC), PE en allophycocyanin (APC) als alternatief.</li>
</ol>3. chirurgie procedure om de inguinale drainage lymfeklier verwijderen
<ol><li>Euthanize muizen met co2 verstikking gevolgd door cervicale dislocatie.</li>
	<li>Immobiliseer muizen op het acryl podium met plakband en breng minerale olie met een wattenstaafje aan op de buikhuid om pels depositie rond de incisie te voorkomen (Figuur 1b). Het verwijderen van bont is niet nodig.</li>
	<li>Voer een middenlijn incisie met behulp van microchirurgie gebogen schaar (11,5 cm) en microchirurgie gebogen Tang (12,5 cm) in de buik van de schaambeen naar de xifoïde proces (figuur 1c).</li>
	<li>Dissocieren de buikspieren van de huid (figuur 1d).</li>
	<li>Maak horizontale huid incisies aan de boven-en onderkant van de verticale incisie lijn om huid kleppen te maken aan de kant van de belangstelling (afhankelijk van de zijkant van de antilichaammix injectie) en flap de huid om de lymfeklier te visualiseren (Figuur 1e).</li>
	<li>Plak de skin-flap op de acrylplaat (Figuur 1f).</li>
	<li>Verwijder de inguinale drainage lymfeklier met behulp van microchirurgie gebogen Tang (Figuur 1f). Lymfeklier zal verschijnen als een translucid, meestal bilobular, bol onder de huid.</li>
</ol>4. chirurgie procedure om de popliteale drainage lymfeklier te verwijderen
<ol><li>Euthanize muizen met co2 verstikking gevolgd door cervicale dislocatie.</li>
	<li>Immobiliseer muizen op een gevoelige positie op acryl podium met plakband en breng minerale olie met een wattenstaafje in de kuit en knie (Figuur 2a-D).</li>
	<li>Voer een middenlijn incisie in het kalf van de hiel naar de knie (Figuur 2E, F).</li>
	<li>Dissociëren de Kalver spier massa van de huid (figuur 2F, G).</li>
	<li>De popliteale Fossa (figuur 2g) blootstellen. Popliteale lymfeklier zal verschijnen als een translucid Sphere in de popliteale Fossa.</li>
	<li>Verwijder de lymfeklier van de popliteale met behulp van een microchirurgie gebogen Tang (figuur 2g).</li>
	<li>Als alternatief, draai de muis over op rugligging positie, en benaderen van de popliteale Fossa tussen biceps musculus femoris en semitendinosus voor de verwijdering van de popliteale LN door het uitvoeren van een middellijn incisie in het kalf van de hiel naar de knie gevolgd door dissociatie van de kalf Musculatuur van de huid. Opmerking: Popliteal Fossa is een ondiepe depressie gelegen aan de achterkant van het kniegewricht. Open zorgvuldig om de lymfeklier van de popliteale te zien.</li>
</ol>5. voorbereiding van lymfeklieren
<ol><li>Plaats het hele orgel in een kweek schaal met glazen bodem (35 mm x 10 mm) en verwijder het vet dat het orgel omringt met behulp van microchirurgie gebogen Tang (Figuur 1G-I en figuur 2H).</li>
	<li>Centraliseer het orgel in het midden van het gerecht (figuur 1J en afbeelding 2H).</li>
	<li>Bedek het orgel met een fragment van delicate taak wissers en houd het doorweekt met kamertemperatuur zoutoplossing 0,9% of fosfaat buffer (Figuur 1K-M en figuur 2H). Opmerking: het is niet nodig om lymfeklieren te wassen na verwijdering of om de lymfeklier extractie in de afzuigkap uit te voeren.</li>
</ol>6. ex-vivo confocale microscopie (beeldvorming)
<ol><li>Plaats de Petri schaal in de omgekeerde confocale Microscoop sleuf (figuur 1N en Figuur 2uur).</li>
	<li>Beeld LNs onder een confocale Microscoop (figuur 1O en afbeelding 2H).</li>
	<li>Haal eerst de juiste focus door het conventionele licht van de confocale Microscoop te gebruiken met 4x of 10x objectief. Verander dan van de licht functie naar de laser modus. Opmerking: als de confocale Microscoop geen 4x-doelstelling bevat, kan de scherpstelling perfect worden verkregen met behulp van de 10x-doelstelling.</li>
	<li>Pas de laser kracht, offset en Gain aan met behulp van een Isotype-gekleurd, niet-gekleurd of niet-fluorescerende monster (tabel 1) om autofluorescentie en onspecifieke kleuring te verwijderen van fluorescerende-gelabelde antilichamen zoals die gebruikt in de beelden die in dit manuscript (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 en PE anti-F4/80).</li>
	<li>Pas Z -en XY -posities aan met behulp van de Micrometrische en Chariot, respectievelijk, op het gebied van belang in de lymfeklier.</li>
	<li>Verkrijg afbeeldingen onder 4x, 10x en 20x doelstellingen gericht op de LN structuur en cellulaire distributie. Gebruik 1024 x 1024-pixel definitie. Opmerking: Verkrijg minimaal vijf afbeeldingen in verschillende velden per doelstelling per dier.</li>
	<li>Analyseer afbeeldingen met behulp van een afbeeldings software om kanalen te scheiden, schaal en kleuren van interesse toe te voegen en de 3D-weergave te reconstrueren.</li>
</ol>

<ol><li>Willard-Mack, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of lymph nodes.</a> Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).</li>
<li>Tas, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antibody+affinity+maturation+in+germinal+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers.</a> Science. 351, 1048-1054 (2016).</li>
<li>David, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Mass+Cytometry+and+Imaging+Analysis+Reveals+Origin%2C+Location%2C+and+Functional+Repopulation+of+Liver+Myeloid+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice.</a> Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).</li>
<li>Rezende, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+T+cells+control+humoral+immune+response+by+inducing+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation.</a> Nature Communications. 9, 3151(2018).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+triple-fluorescent+mouse+strain+allows+a+dynamic+and+spatial+visualization+of+different+liver+phagocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Anais+da+Academia+Brasileira+de+Ciencias%22%5BJournal%5D)">Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo.</a> Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317(2019).</li>
<li>Ajami, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+reveals+distinct+populations+of+brain+myeloid+cells+in+mouse+neuroinflammation+and+neurodegeneration+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models.</a> Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).</li>
<li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li>
<li>McElroy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+LYVE-1+antibody+to+image+dynamically+lymphatic+trafficking+of+cancer+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo.</a> Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).</li>
<li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li>
<li>Hauser, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+germinal-center+B+cell+migration+in+vivo+reveals+predominant+intrazonal+circulation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns.</a> Immunity. 26, 655-667 (2007).</li>
<li>Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+germinal+center+selection+events+during+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging of germinal center selection events during affinity maturation.</a> Science. 315, 528-531 (2007).</li>
<li>Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+splenic+marginal+zone+B-cell+shuttling+and+follicular+B-cell+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress.</a> Nature. 493, 684-688 (2013).</li>
<li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li>
<li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).</li>
<li>Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+receptor+2+mediates+the+retention+of+immature+B+cells+in+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids.</a> Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+metabolic+shifts+during+neonatal+development+reprogram+liver+identity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function.</a> Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li>
<li>Roozendaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conduits+mediate+transport+of+low-molecular-weight+antigen+to+lymph+node+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles.</a> Immunity. 30, 264-276 (2009).</li>
<li>Sarder, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-near-infrared+multiphoton+microscopy+interrogates+intact+tissues+at+deeper+imaging+depths+than+conventional+single-+and+two-photon+near-infrared+excitation+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes.</a> Journal of Biomedical Optics. 18, 106012(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De combinatie van beeldvorming met andere technieken, waaronder moleculaire biologie en hoog-dimensionale immunophenotypering heeft ons vermogen om immuuncellen in hun inheemse context te onderzoeken, verbeterd. In feite, terwijl andere benaderingen weefsel spijsvertering en celisolatie kunnen vereisen-wat kan leiden tot verlies van weefsel integriteit-het gebruik van in vivo of ex vivo beeldvorming geeft een groot voordeel bij het onderzoeken van verschillende subtypen van cellen in een geografische mode<sup class="xref...

Lymfeklieren (LNs) zijn Ovoid-vormige organen wijd aanwezig in het lichaam met de cruciale functie van het overbruggen van de aangeboren en adaptieve immuunresponsen. LNs filteren de lymfe om vreemde deeltjes en kankercellen te identificeren om een immuunrespons tegen hen te monteren1. Antigeen cellen (Apc's), T-cellen en B-cellen werken samen om antigeen-specifieke antilichamen (Humorale immuniteit) en cytotoxische lymfocyten (cellulaire immuniteit) te genereren om de vreemde deeltjes en kankercellen2te elimineren. Zo zal het begrijpen van de dynamiek van de immuuncellen die aanwezig zijn in het lymfestelsel belangrijke gevolgen hebben voor de vaccin ontwikkeling en kanker immunotherapie.
De opkomst van krachtige microscopen-inclusief nieuwe confocale en superresolutie microscopen-heeft een buitengewone vooruitgang toegestaan in het begrijpen van hoe verschillende immuuncelpopulaties zich gedragen in hun eigen omgeving3. Het is nu mogelijk om verschillende gelijktijdige celsubtypen te maken met behulp van een combinatie van sondes met genetisch gemodificeerde muizen die fluorescerende eiwitten onder controle van specifieke doelstellingen4,5uitdrukken. In feite zijn hoge dimensionale technieken, waaronder massa cytometrie en multi-parametrische stromings analyse, van cruciaal belang geweest om onze kennis uit te breiden over verschillende compartimentalisatie en functionaliteit van de immuuncel in de gezondheid en ziekte6, 7. om monsters voor deze technieken voor te bereiden, hebben weefsels echter spijsvertering nodig en worden cellen gescheiden van hun natuurlijke milieu om te worden geanalyseerd in celsuspensies. Om deze beperkingen te overtreffen en een betere vertaling in de biologie mogelijk te maken, is het doel van het hier voorgestelde protocol om een eenvoudige methodologie toe te passen op beeld ex vivo hele lymfeklieren met behulp van voorraden confocale microscopen met het voordeel van verbeterde snelheid, weefsel behoud van de structuur en de levensvatbaarheid van de cellen in vergelijking met de conventionele immunofluorescentie kleuring. Door deze aanpak te gebruiken, konden we aantonen dat muizen deficiënte voor γδ T-cellen, een subtype van T-lymfocyten dat betrokken is bij vroege verdediging van de gastheer tegen pathogenen4, follikels en T-celzones hebben aangetast in vergelijking met wild type muizen. Deze bevindingen lieten ons toe om een studie uit te voeren waarin we hebben aangetoond dat de γδ T-cellen een cruciale rol spelen in de homeostase van lymfoïde organen en humorale immuunrespons4. Bovendien biedt dit protocol een fysiologisch traject voor sondes en antilichamen om de lymfeklier te bereiken, omdat ze subcutaan worden toegediend en afgevoerd door de weefsel lymfatische circulatie, voortbouwend op eerdere rapporten die in situ labeling werden gebruikt met antilichamen om lymfatische structuren te visualiseren8,9, Germinal CenterDynamics 10,11,12, en doelen gemakkelijk toegankelijk voor de bloedstroom13 ,14,15.

<table><tbody><tr><td>BV421 anti-CD4</td><td>BD Horizon</td><td>562891</td><td>GK1.5; 0.2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BB515 anti-CD19</td><td>BD Horizon</td><td>564509</td><td>1D3; 0.2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BB515 Rat IgG2a, &kappa; Isotype Control</td><td>BD Horizon</td><td>564418</td><td>R35-95; 0.2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control</td><td>BD Horizon</td><td>562603</td><td>R35-38 0.2 mg mL-1</td></tr><tr><td>Cellview kweekschaal</td><td>Greiner-Bio</td><td>627861</td><td>35x10 mm met glazen bodem</td></tr><tr><td>Insuline spuit</td><td>BD Plastipak</td><td>-</td><td>Insuline U-100</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech Science Brand</td><td>7557</td><td>maat 21 x 20 cm / 100 vellen per doos</td></tr><tr><td>Gebogen microchirurgie pincet</td><td>WEP Surgical Instruments</td><td>op bestelling gemaakt</td><td>12.5 cm</td></tr><tr><td>Gebogen microchirurgie schaar</td><td>WEP Surgical Instruments</td><td>op bestelling gemaakt</td><td>11.5 cm</td></tr><tr><td>Naald</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>-</td><td>30 gauge &times; &frac12; inch</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Te + A1R confocale kop</td><td>Nikon</td><td>-</td><td>geladen met de belangrijkste 4 laser lijnen (405, 488, 543 en 647 nm)</td></tr><tr><td>PE anti-F4/80</td><td>BD Pharmigen</td><td>565410</td><td>T45-2342; 0.2 mg mL-1</td></tr><tr><td>PE Rat IgG2a, &kappa; Isotype Control</td><td>BD Pharmigen</td><td>553930</td><td>R35-95; 0.2 mg mL-1</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710 confocale microscoop</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>geladen met de belangrijkste 4 laser lijnen (405, 488, 543 en 647 nm)</td></tr></tbody></table>

visualisering van lymfeklieren structuur en cellulaire lokalisatie met behulp van ex-vivo confocale microscopie

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymfeklieren (LNs) zijn organen verspreid in het lichaam, waar de aangeboren immuunresponsen verbinding kunnen maken met de adaptieve immuniteit. In feite zijn LNs strategisch geïnterposeerd in het pad van de lymfevaten, waardoor intiem contact van weefsel antigenen met alle ingezeten immuuncellen in de LN mogelijk is. Dus, het begrijpen van de cellulaire samenstelling, distributie, locatie en interactie met behulp van ex vivo hele LN Imaging zal toevoegen aan de kennis over hoe het lichaam coördineert lokale en systemische immuunresponsen. Dit protocol toont een ex-vivo-beeldvormings strategie na een in vivo-toediening van fluorescerende-gelabelde antilichamen die een zeer reproduceerbare en eenvoudig uit te voeren methodologie mogelijk maakt door gebruik te maken van conventionele confocale microscopen en voorraad reagentia. Door subcutane injectie van antilichamen is het mogelijk om verschillende celpopulaties te labelen in drainage LNs zonder de weefselstructuren te beïnvloeden die potentieel kunnen worden aangetast door een conventionele immunofluorescentie microscopie-techniek.

Dit manuscript toont technieken om inguinale en popliteale lymfeklieren te verwijderen zonder hun structuur te beschadigen na de injectie van fluorescerende-gelabelde antilichamen om specifieke celpopulaties in deze organen te vlekken (Figuur 1 en Figuur 2 ).
De krachtige combinatie van immunolabeling van LN-cellen met BV421 anti-CD4 en BB515 anti-CD19 en confocale beeldvormings analyse definieerde de lokalisatie van T-cellen (CD4 +) ...

Dit protocol beschrijft een techniek om verschillende celpopulaties in aftappen van lymfeklieren zonder veranderingen in de orgaan structuur te beeld.

Visualisering van lymfeklieren structuur en cellulaire lokalisatie met behulp van ex-vivo confocale microscopie

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Dit reproduceerbare en eenvoudig uit te voeren protocol maakt gebruik van een ex-vivo lymfeklierbeeldvormingsstrategie om het afta-afvoeren van in-vivo toegediende fluorescerende gelabelde antilichamen tegen lokale secundaire lymfoïdeorganen bij te houden. Het aantonen van deze techniek maakt een specifieke visualisatie van de procedure mogelijk, die een succesvolle uitvoering van het protocol kan vergemakkelijken. Dit is een zeer eenvoudige en eenvoudige techniek die kan worden uitgevoerd door iedereen.Het enige uitdagende aspect is de muis behandeling, die enige training vereist. Deze techniek heeft het voordeel van een verbeterde snelheid weefsel inspanning behoud en cel levensvatbaarheid in vergelijking met de conventionele fluorescerende kleuring methoden. De opleiding van de procedure zou Bruna Tatematsu, een technicus van het laboratorium zijn.Verdun de antilichamen van belang, geconjugeerd aan de juiste fluoroforen, in 100 microliter van PBS voor inguinale lymfeklierbeeldvorming, of 50 microliter pbs voor popliteale lymfeklierbeeldvorming. Voor inguinale lymfeklier beeldvorming, laad 100 microliter van de antilichaam cocktail in een een milliliter insulinespuit, uitgerust met een 30 meter door halve inch naald, en onderhuids injecteren van de antilichamen in de binnenkant dij van de experimentele muis. Voor popliteale lymfeklierbeeldvorming, injecteer 50 microliter van de antilichaamcocktail onderhuids in één pootpad van het experimentele dier.Breng het dier dan terug naar zijn thuisbox. Voor inguinale drainerende lymfeklier oogst, na het wachten ten minste drie uur na de injectie, immobiliseren van de muis op de acryl stadium met plakband en minerale olie toe te passen op de buikhuid. Gebruik standaard microchirurg schaar en microchirurg gebogen tangen om een midline huid incisie in de buik te maken van de schaamstreek naar de xyphoid proces, en dissociaal de buikspierculatuur van de huid.Maak horizontale huidinsnijdingen in de boven- en onderkant van de verticale incisielijn, om huidflappen aan de zijkant van de injectie te creëren en trek de huid in om de lymfeklier te visualiseren. Zet de huidflap vast aan de acrylplaat en gebruik de tangen om de doorschijnende, meestal bilobulaire bolvormige inguinale drainerende lymfeklier te verwijderen. Voor popliteal drainerende lymfeklieroogst, ten minste 12 uur na de injectie, immobiliseer de muis in de gevoelige positie op een acrylstadium.Breng minerale olie aan op het kalf en de knie aan de geïnjecteerde kant van het dier. Maak vervolgens een middellijn incisie in het kalf van de hiel tot de knie, en dissociate het kalf spierstelsel van de huid. Ontmasker de popliteal fossa.De popliteale lymfeklier verschijnt als een doorschijnende bol in de fossa. Verwijder vervolgens de lymfeklier met de microchirurgie gebogen tangen. Om de lymfeklier voor te bereiden op beeldvorming, plaats de hele organen in een 35 bij 10 millimeter kweekschotel met een glazen bodem en gebruik tangen om vet rond het weefsel te verwijderen.Centreer het orgaan in het midden van de schotel, en bedek het weefsel met een stuk zout-doorweekte delicate taakwisser. Voor ex vivo beeldvorming, plaats de schotel in de omgekeerde confocale microscoop sleuf en gebruik het conventionele licht van de confocale microscoop en de 4-10X doelstelling om de juiste focus te verkrijgen. Verander van de lichtfunctie naar de lasermodus en gebruik een isotoop-gekleurd, niet-gekleurd of niet-fluorescerend monster om de laserkracht aan te passen, te compenseren en te winnen om de automatische fluorescentie en eventuele niet-gespecificeerde kleuring te verwijderen.Verwerf afbeeldingen onder de 4, 10 en de 20X-doelstellingen gericht op de lymfeklierstructuur en cellulaire distributie en gebruik een definitie van 1024 bij 1024 pixels. Gebruik vervolgens een geschikt softwareprogramma voor beeldanalyse om de kanalen te scheiden, de schaal en kleuren van belang toe te voegen en om de 3D-weergave te reconstrueren. De krachtige combinatie van immunolabeling van lymfekliercellen met anti-CD4 en anti-CD19 antilichamen en confocale beeldvormingsanalyse maakt de lokalisatie van T- en B-cellen binnen de inguinale lymfeklieren mogelijk.In de popliteale lymfeklieren, zoals in het inguinale weefsel, worden de B-celzakjes omringd door T-celpopulaties, een kenmerk van de lymfeklierstructuur. Zoals waargenomen in deze beelden, fagocyten niet internaliseren de geïnjecteerde antilichamen, wat aangeeft dat de B en T cel vlekken specifiek is. Bovendien geeft een herreconstructie van de etikettering aan dat de T- en B-celkleuring elkaar niet overlappen, wat de specificiteit van de kleuring verder bevestigt.Monocellulaire cellen worden waargenomen in de inguinale lymfeklier, met inbegrip van de subcapsulaire sinus. Met de meerderheid van de mononucleaire cellen uitdrukken CX3XR1, gevolgd door CCR2 en CXCR31CCR2 dubbele positieve cellen. Hetzelfde patroon van celverdeling en celfenotypes wordt waargenomen in de popliteale lymfeklier.Beide lymfeklieren vertonen ook donkere gebieden zonder mononucleaire celreceptorexpressie die worden bezet door lymfocyten. Bovendien zijn mononucleaire cellen schaars binnen het binnenste gebied van de lymfeklieren, die geconcentreerd blijven in de buitenste gebieden van het weefsel, wat aangeeft dat deze cellen voornamelijk de lymfekliersindesinus bezetten. Het antilichaammengsel moet precies in het onderhuidse weefsel worden geïnjecteerd voor het lymfestelsel om de antilichamen goed af te voeren op de lymfeklier.Deze methode kan worden toegepast op de biodistributie van fluorescerende gelabelde geneesmiddelen, en op celtargetingstudies van fluorescerende nanodeeltjes.

visualizing-lymph-node-structure-cellular-localization-using-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Twee-foton beeldvorming heeft blootgelegd lymfocyten beweeglijkheid en cellulaire interacties binnen de lymfeklier onder basale omstandigheden en gedurende een immuunrespons 1. Hier laten we zien adoptieve overdracht van T-cellen, isolatie van de lymfeklieren, en beeldvorming beweeglijkheid van de CD4 + T-cellen in de geëxplanteerd lymfeklier.

Dissection en 2-Photon Imaging van perifere lymfeklieren in Muizen

Dit protocol beschrijft een methode om de afbeelding fluorescerende T-cellen geïntroduceerd in lymfeklier plakjes. De techniek maakt real-time analyses van T-cel migratie met traditionele groothoek fluorescentie of confocale microscopen.

Ex vivo beeldvorming van T-cellen in muizen lymfkliertest Plakjes met Widefield en confocale microscopen

Recente ontwikkelingen in de 2-foton microscopie hebben real-time...

Intravitale Imaging van de muis knieholte lymfkliertest

Recent ontwikkelde beeldvormende technieken met behulp van nabij-infrarood fluorescentie (NIRF) kan helpen verduidelijken van de rol het lymfestelsel speelt in kanker metastase, immuunrespons, wondheling, en andere lymfatische-geassocieerde ziekten.

Niet-invasieve optische beeldvorming van de lymfatische vasculatuur van een muis

This video demonstrates a dissection technique to harvest popliteal draining lymph nodes from the mouse hind legs. Lymph nodes play a critical role in bridging innate and adaptive immunity, and harvesting intact lymph nodes — with a preserved tissue structure and cellular viability — can help study local and systemic immune responses.

A Dissection Method to Harvest Murine Popliteal Draining Lymph Nodes for Ex Vivo Imaging

Hoge-resolutie intravitale beeldvorming met verbeterd contrast tot 120 urn diepte lymfklieren van volwassen muizen wordt bereikt door ruimtelijk moduleren van de excitatie patroon van een multi-focale twee-foton microscoop. In 100 micrometer diepte gemeten we resoluties van 487 nm (lateraal) en 551 nm (axiaal), waardoor verstrooiing en diffractie grenzen omzeilen.

Hoogst vastbesloten Intravitale Striped-verlichting Microscopie van Germinal Centers

De extracellulaire matrix ondergaat ingrijpende verbouwing tijdens de wondgenezing, ontsteking en het ontstaan ​​van tumoren. Wij presenteren een nieuwe intravitale immunofluorescentie microscopie benadering van de dynamiek van fibrillaire en mesh-achtige matrix componenten met hoge ruimtelijke en temporele resolutie met behulp van epifluorescentie of twee-foton microscopie visualiseren.

Langdurige Intravitale Immuunfluorescentie beeldvorming van Tissue Matrix Bestanddelen met Epifluorescentie en twee-foton microscopie

Dit protocol beschrijft een methode om te afbeelding resident tumor-infiltreren CD8 T cellen aangeduid met fluorescently gekoppelde antilichamen binnen de menselijke longen tumor segmenten. Deze techniek staat real-time analyses van CD8 T-cel migratie met behulp van de confocal microscopie.

Ex Vivo Beeldvorming van Resident CD8 T lymfocyten in menselijke longen Tumor plakjes met behulp van confocale microscopie

Een protocol wordt gepresenteerd combineren weefsel clearing met licht blad fluorescentie microscopie (LSFM) om driedimensionale en cellulaire resolutie beelden van de lymfevaten en lymfeklieren (LN' s) het verzamelen van de cerebrospinale vloeistof (CSF) en spinale epidurale vloeistof te verkrijgen.

Driedimensionale beeldvorming van de wervellymfefelietische vasculatuur en drainage met behulp van iDISCO+ en Light Sheet Fluorescentie Microscopie

Hier wordt een protocol gepresenteerd om muis meningeale lymfevaten (MLV's) te beoordelen, die een belangrijke rol spelen bij meerdere neurologische aandoeningen. Het doel van dit protocol is het bieden van een geïntegreerde methode die zowel functionele evaluatie van tracerdrainage als gedetailleerde morfologische karakterisering van het dorsale MLV-netwerk mogelijk maakt.

Geïntegreerd protocol voor het beoordelen van meningeale lymfekatica: Cisterna magna-injectie, lymfeklierbeeldvorming, meningeale dissectie en whole-mount kleuring

Leer ex-vivo beeldvorming van lymfeklieren met fluorescerende antilichamen voor immunologisch onderzoek bij muizen. Deze methode behoudt weefselstructuur en celviabiliteit voor gedetailleerde visualisatie van T- en B-cellen.

Visualisering van lymfeklieren structuur en cellulaire lokalisatie met behulp van ex-vivo confocale microscopie

Meer video's verkennen