Standaard werkings procedure voor Lyssavirus surveillance van de BBT-populatie in Taiwan

Lyssavirus is een dierentuin-no-tic pathogenen. Om de aanwezigheid van Lyssavirus in Taiwanese vleermuispopulaties te beoordelen, hebben we een bewakingsprogramma gestart. En het identificeerde met succes vier Lyssavirussen van 2016 tot 2018.

Dit protocol is een stapsgewijze inleiding tot vi-al Lyssavirus surveillance in Taiwan. We hopen dat het nuttig zal zijn om onderzoek te doen naar mensen die geïnteresseerd zijn in vi-al Lyssavirus surveillance. Het is belangrijk om het juiste tac-vat symbool aan te sluiten.

Een dode of stervende vleermuis is geschikter dan een levende vleermuis voor Lyssavirus surveillance. Afhankelijk van de bioveiligheidsvoorschriften van het land waar het laboratorium zich bevindt; de volgende procedures uitvoeren in een geschikt laboratorium op bioveiligheidsniveau. En zorg ervoor dat de onderzoekers momenteel gekwalificeerd zijn en dragen de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.

Laat een vleermuisecoloog bij het verzamelen van zwakke of zieke vleermuizen of karkassen de vleermuissoorten identificeren aan de morfologische kenmerken van het monster. Dien bij elk vleermuismonster een informatieblad in bij het laboratorium, met inbegrip van de verzamelplaats, de soorten, de klinische symptomen en andere relevante gegevens. Voordat u met de necroscopie begint, onderzoekt u alle externe openingen en fotografeert u de externe vleermuizen, met name het hoofd, de oren en de vleugels voor soortendifferentiatie.

Om een oraal wattenstaafje monster te verzamelen plaats de vleermuis in ventrale recumbency op een steriele dissectie bord en bevestig het hoofd met pincet. Gebruik een scalpel om de huid langs de middellijn van het kuitgebied te snijden;en trek de huid aan de zijkanten, om een incisie in de schedel langs de middellijn van het kalfsgebied te maken. Open de schedel met een pincet om het hersenweefsel bloot te stellen en gebruik de pincet om het hersenweefsel voorzichtig te scheiden van het verbonden zenuwweefsel.

Snijd de dwarsdoorsnede van de hersenen, met inbegrip van de hersenstam en cerebellum, en licht aanraken van de gesneden oppervlak van het hersenweefsel met glazen dia's om uitstrijkje indrukken te maken. Druk op de dia op lensweefsel om het overtollige weefsel te verwijderen en bevestig de uitstrijkjeafdruk dia's in min 20 graden Celsius aceton gedurende 30 minuten. Bevestig dan een klein stukje vers hersenweefsel, in formaline, voor histopathologisch onderzoek.

En plaats de rest van het weefsel in emi-em 10 voor nucleïnezuur extractie. Vervolgens insnijden van de huid van het spruitstuk naar de anus langs de middellijn van het lichaam, en gebruik maken van de pincet op te heffen en te scheiden van de huid en onderstrepen spierweefsels;om de verzameling van de speekselklieren, gelegen in de buurt van het mandibulaire bot mogelijk te maken. Licht tillen van het borstbeen met de pincet, gebruik de scalpel om het borstbeen en de buikwand langs de middellijn te snijden en snijd de sleutelbeen.

Gebruik naalden om de linker en rechter ribbenkast aan de dissectieraad te bevestigen, om de borstholte te openen. En noteert de grove legioenen en de mate van post mortem verandering. Gebruik vervolgens de pincet en scalpel om de viscerale weefsels te verwijderen, indien van toepassing voor de geplande downstream-analyse.

Om een directe fluorescerende antilichaamtest aan het einde van de fixatie uit te voeren, droogt u de uitstrijkafafafingsplaten uit en selecteert u ten minste twee geconjugeerde anti-rabiësantilichamen voor de analyse. Filter één antilichaam op elke dia door een zeef van 0,45 micrometer. En de glijbanen 30 minuten uitbroeden bij 37 graden celsius in een vochtige kamer.

Aan het einde van de incubatie, afvoer van de overtollige conjugaat en was de dia's met PBS. Gebruik vervolgens een klein volume van 10%glycerol om cover-slips op de dia's te monteren en de dia's door fluorescentiemicroscopie te schetsen. Wanneer ofwel de fluorescerende antilichaam test of de RT-PCR analyse wijst op positiviteit, homogeniseren de hersenen specimen in de 10%suspensie in emi-en 10 en sediment de weefsels fleu-rry door centrifugatie.

Inenting 200 microliter van de super-nat-en met drie keer 10 tot de 6e muis neuroblastoom cellen en een milliliter emi-en 10 voor een uur bij 37 graden Celsius en 1%kooldioxide. En breng de hersenen homogeen-cel suspensie naar een 25 centimeter kwadraatkolf, met zes milliliter verse emi-en 10. Op een milliliter van de hersenen homogeen-cel suspensie in een vier-goed Teflon-gecoate glazen glijbaan, met een zes millimeter diameter en plaats de dia op 37 graden Celsius en 1% kooldioxide voor drie tot vier dagen.

Na fixatie met 100% aceton, vlek de dia's met dezelfde twee fluorescentie geconjugeerde anti-rabiës antilichamen zoals gebruikt voor de fluorescentie antilichaam test. En visualiseer de dia's door fluorescerende microscopie om het aantal intracida-plas-mic insluitsels te bepalen. Na het trypsinizing en sub-culturing van de ingeënte celcultuur volgens standaardprotocollen, de terugkeer van de koude-cultuur naar de celcultuur incubator voor nog eens drie tot vier dagen met herhalen tellen van het aantal geïnfecteerde cellen zoals net aangetoond totdat een 100% infectiviteit is bereikt.

Van januari 2014 tot mei 2017 werden 332 vleermuiskarkassen van 13 soorten verzameld voor toezicht. In deze representatieve analyse van twee positieve vleermuisgevallen testte de hersenindruk negatief met behulp van de fluorescerende antilichaamtest met een van de commerciële, fit-sy geconjugatte anti-rabiës antilichamen, terwijl de RT-PCR die elk van de twee verschillende primersets gebruikt, positieve resultaten opleverde. Uit de onderwerping van de verkregen ampli-con sequentie aan het opvragen van de Gen-bank in de database van Gen bleek dat de volgorde vergelijkbaar was met Lyssavirussen met identiteiten van minder dan 79%, ter ondersteuning van de identiteit van de gedetecteerde Lyssavirussen.

Twee Lyssavirussen werden vervolgens met succes geïsoleerd uit de twee hersenen, zoals bevestigd door fluorescentie antilichaam test en sequencing. De belangrijkste stap voor het bepalen van Lyssavirus positiviteit zijn de fluorescentie antilichaam test en de RT-CPR analyse. Het gebruik van twee of meer anti-rabiës antilichamen in de primer sets wordt sterk aanbevolen.

Naast Lyssavirus kunnen andere ziekteverwekkers van de dierentuin en de niet-ical knuppel worden gecontroleerd gebruikend gesloten kenmerkende methodes. De gegevens kunnen vervolgens worden gebruikt om het publiek te informeren over het vermijden van contact met vleermuizen. Hoe meer we in staat zijn om vleermuis Lyssavirus te bestuderen, hoe meer we in staat zullen zijn om de evolutie en de impact ervan op de volksgezondheid te begrijpen.