Name: Evaluatie van Synaptic multipliciteit met behulp van geheel-cel Patch-clamp electrofysiologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Leer synaptische multipliciteit evalueren in neuronen met behulp van whole-cell patch-clamp elektrofysiologie op acute hersensneden. Deze methode biedt inzicht in synaptische transmissie en neurale communicatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.S. ontving Ontario Graduate beurs. Wi ontving een nieuwe detective Fellowship van geestelijke gezondheidsonderzoek Canada. Dit werk wordt ondersteund door de exploitatiesubsidies aan W.I van de natuurwetenschappen, Engineering Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) en de Canadian Institute voor gezondheidsonderzoek (PJT 148707).

Alle dierproeven worden goedgekeurd door het Comité Animal Care van de University of Western Ontario overeenkomstig de Canadese Raad op Animal Care Guidelines (AUP #2014-031).
1. oplossingen
<ol><li>
Snijden van oplossing
	<ol>
<li>Zie tabel 1 voor de samenstelling van de segmenteringshulplijnen oplossing.</li>
		<li>Een 20 x stamoplossing bereiden en op te slaan bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.</li>
		<li>Voor 1 x segmenteringshulplijnen oplossing, los van de NaHCO3, glucose en sacharose in ddH2O, en voeg de voorraad van 20 x. Zorg ervoor dat de osmolariteit is tussen 315-320 mOsm en opslaan van de oplossing voor niet meer dan 1 week bij 4 ° C.</li>
		<li>Vul twee bekers met 100 mL van het snijden van de oplossing en bestrijk ze met parafilm. Chill de oplossing in een vriezer totdat de oplossing gedeeltelijk bevroren wordt (ongeveer 20 min in de vriezer-80 ° C). Met behulp van een gasbuis dispersie, bubble beide bekerglazen van het snijden van de oplossing met 95% O2/5% CO2 voor 20 min op ijs.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="5">Oplossing concentraties (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Snijden</td>
			<td>Normale aCSF</td>
			<td>Lage Ca2 + aCSF</td>
			<td>SR+ aCSF</td>
			<td>Pipetteer/interne</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>87</td>
			<td>126</td>
			<td>126</td>
			<td>126</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0,5</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>SrCl2
</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>2.5</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>7</td>
			<td>1.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1.5</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>1,25</td>
			<td>1,25</td>
			<td>1,25</td>
			<td>1,25</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>25</td>
			<td>26</td>
			<td>26</td>
			<td>26</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glucose</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sacharose</td>
			<td>75</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>K-gluconaat</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>116</td>
		</tr>
<tr>
<td>NB-gluconaat</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2-EGTA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2ATP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na3GTP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: De samenstelling van verschillende oplossingen.
<ol start="2"><li>
aCSF (voor segment herstel en onderhoud)
	<ol>
<li>Zie tabel 1 voor de samenstelling van de aCSF.</li>
		<li>Een 20 x stamoplossing bereiden en op te slaan bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.</li>
		<li>Voor 1 x aCSF, los NaHCO3 en glucose in ddH2O en voeg de voorraad van 20 x. Zorg ervoor dat de osmolariteit is tussen 298-300 mOsm. Gebruik de oplossing binnen 1 dag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
aCSF (lage Ca2 + voor opname)
	<ol>
<li>Zie tabel 1 voor de samenstelling van de lage Ca2 + aCSF.</li>
		<li>Een 20 x stamoplossing bereiden en op te slaan bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.</li>
		<li>Voor 1 x lage Ca2 + aCSF, los NaHCO3 en glucose in ddH2O en voeg hieraan 20 x (CaCl2 en MgCl2 gratis) voorraad en CaCl2 MgCl2 opgegeven concentraties. Zorg ervoor dat de osmolariteit is tussen 298-300. Gebruik de oplossing binnen 1 dag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
aCSF (Sr2 + voor opname)
	<ol>
<li>Zie tabel 1 voor de samenstelling van de Sr2 + aCSF.</li>
		<li>Een 20 x stamoplossing bereiden en op te slaan bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.</li>
		<li>Voor 1 x Sr2 + aCSF, los NaHCO3 en glucose in ddH2O en voeg hieraan 20 x (CaCl2 en MgCl2 gratis) voorraad, SrCl2 en MgCl2 opgegeven concentraties. Zorg ervoor dat de osmolariteit is tussen 298-300. Gebruik de oplossing binnen 1 dag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Interne oplossing
	<ol>
<li>Zie tabel 1 voor de samenstelling van de K-gluconaat gebaseerd interne oplossing.</li>
		<li>Om 20 mL interne oplossing, voegt u 15 mL moleculaire biologie rang water aan een tube van 50 mL. Voer de volgende stappen op het ijs.</li>
		<li>Voorbereiding van de volgende oplossingen tevoren aan 1 M voorraad concentraties in moleculaire biologie rang water. Toevoegen (in mL): 2.32 K-gluconaat, 0,24 nb-gluconaat, 0,20 HEPES, 0.16 KCl, 0,05 K2-EGTA, 0,04 MgCl2 tot en met de tube van 50 mL.</li>
		<li>Voeg 100 µL van 0,3 M Na3GTP.</li>
		<li>Weeg 44.08 mg K2ATP in een tube van 2 mL microcentrifuge en voeg 1 mL moleculaire biologie rang water, dan toevoegen aan 50 mL-buis.</li>
		<li>Breng de pH op 7,2-7.4 met 1 M KOH. Zorg ervoor dat de osmolariteit is tussen 283-289 mOsm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. slice voorbereiding
<ol><li>
Bereiden van hulpmiddelen
	<ol>
<li>Voeg 200 mL van aCSF aan de kamer van de recovery (opgebouwd uit een bekerglas van 250 mL met 4 wells en verrekening) en plaats de herstel-zaal in een waterbad (35 ° C).</li>
		<li>Bedek de zaal met een paraffine-film en bubble voortdurend het aCSF met 95% O2/5% CO2 met behulp van een glazen dispersie buis voor minstens 20 min.</li>
		<li>De dissectie voorbereiden door het opzetten van de tools (scalpel, schuine fijne schaar, pincet, fijne kwast, plastic lepel).</li>
		<li>Vul een injectiespuit 60 mL met ongeveer 15 mL van de ijskoude segmenteringshulplijnen oplossing uit stap 1.1.4.</li>
		<li>Bereiden de dissectie-platform door het plaatsen van een filtreerpapier op het deksel van een goed plaat.</li>
		<li>Bereiden de segmenteringshulplijnen kamer door in het ijs lade plaatst en de lade te vullen met ijs.</li>
		<li>De vibratome instellen door het veiligstellen van een disposable mes in de meshouder.</li>
		<li>Een pipet overdracht door breken het puntje van een pipet van Pasteur en het plaatsen van een rubber-lamp over het einde kapot maken</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ontleden van muis hersenen
	<ol>
<li>Anesthetize het dier in een kamer die verzadigd met 4% Isofluraan totdat spinale reflexen afwezig zijn.</li>
		<li>Decapitate van het dier met een guillotine en snel verwijderen van de hersenen.<ol>
<li>Een middellijn incisie met een mes over de scalpel nr. 22 van rostraal aan caudal maken</li>
			<li>Lateraal schil de hoofdhuid aan elke kant van het hoofd.</li>
			<li>Gebruik fijn schaar te knippen van de schedel aan de ene kant van caudal naar rostraal (met inbegrip van de kant van de frontale botten), met behulp van voorzichtig niet aan de hersenen beschadigen.</li>
			<li>Gebruik pincet te heffen van de schedel stuk uit de hersenen en snel afkoelen van de hersenen met 15 mL ijskoud segmenteringshulplijnen oplossing met behulp van de spuit uit stap 2.1.4.</li>
			<li>Til de hersenen uit de schedel.</li>
			<li>Plaats de hersenen in een van de bekerglazen gevuld met ijskoude segmenteringshulplijnen oplossing (uit stap 1.1.4) borrelen met 95% O2/5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiden van segmenten van muis hypothalamus
	<ol>
<li>Blokkeren van de hersenen voor het gewenste hersenen gebied en snij hoek (bijvoorbeeld voor coronale hypothalame segmenten, trim weg het weefsel rostraal van de optiek opticum en caudal naar de pons met behulp van een mes en zorgen de caudal blok heeft een vlakke ondergrond loodrecht op de basis van de hersenen).</li>
		<li>Met behulp van een geslepen stuk filtreerpapier, halen de hersenen van de voorste kant en lijm van de posterieure zijde aan de plaat van de bedrijf met behulp van instant lijm.</li>
		<li>Snel de bedrijf plaat in de segmenteringshulplijnen kamer plaatsen en vullen de kamer met het snijden van de oplossing van de tweede bekerglas in stap 1.1.4.</li>
		<li>Beveilig de segmenteringshulplijnen kamer en ijs lade op de vibratome.</li>
		<li>Definieer de segmenteringshulplijnen (anterior en posterior naar de hersenen) en beginnen met het snijden van 250 µm dikte coronale segmenten. Aanbevolen parameters: snelheid van 0.10 mm/s, amplitude 2 mm.</li>
		<li>Snijd de plakjes op de juiste grootte voor het gewenste hersenen gebied.</li>
		<li>Herstellen van de segmenten bij 35 ° C gedurende 30-45 min. Dan verwijderen van de kamer van de terugwinning van de opwarming van de aarde bad en toestaan van de segmenten terug te vorderen bij kamertemperatuur voor een extra 30 min. Keep segmenten bij kamertemperatuur voor de rest van de dag en blijven bubble het bad voortdurend met 95% O2/5% CO2 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. geheel-cel Patch ClampRecording
<ol><li>
Trek de patch pipetten
	<ol>
<li>Met de voorgestelde parameters voor de opname van de pipet trekker de handleiding geheel-cel, trek patch pipetten van dikke ommuurde glas een pipet weerstand van 3-5 MΩ.</li>
		<li>Met behulp van een microsyringe (commercieel of zelfgemaakte), vullen een pipet tip met gefilterde interne oplossing. Te een microsyringe, branden het puntje van een spuit van 1 mL en de tip om vallen maken een lange fijne tip.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verkrijgen van de gehele-cel-configuratie
	<ol>
<li>Plaats de pipet opname net boven de slice en offset pipet huidige in de modus van de klem spanning. Lichte positieve druk uitoefenen op de pipet en vergrendel de afsluiter.</li>
		<li>Selecteer een gezonde cel met een intact membraan en aanpak van de cel met het pipet. De overdruk moet leiden tot een lichte verstoring in het weefsel (dat wil zeggen een trage Golf in het weefsel bij het invoeren van).</li>
		<li>Langzaam blijven om de pipet dichter naar de cel met een diagonale beweging totdat de pipet een klein kuiltje op het celoppervlak vormt.</li>
		<li>De overdruk vergrendeling. De cel zal beginnen te vormen van een zegel en de weerstand zal toenemen boven 1 GΩ. In spanning klem, houd de cel op-68 mV.</li>
		<li>Trek iets ergens buiten de cel diagonaal te verwijderen van overdruk uit de cel.</li>
		<li>De snelle en langzame Pipetteer capaciteit compenseren.</li>
		<li>Een kort afzuigen door de buis aangesloten aan de houder van de pipet te doorbreken van de cel en geheel-cel configuratie te krijgen.</li>
		<li>Cel wordt geactiveerd op het membraan test venster in een electrofysiologie Data-acquisitie en analysesoftware (bijvoorbeeld Clampex).</li>
		<li>Vóór elke spanning klem opnemen, uitvoeren van een test van de membraan gebruikend de zelfde software en de relevante parameters opnemen in een lab-boek (membraan weerstand, toegang weerstand en capaciteit).</li>
		<li>Handhaving van de temperaturen van de opname-bad bij 27-30 ° C en het debiet op 1.5-2.0 mL/min voor latere experimenten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. multipliciteit experimenten
<ol><li>
Experiment 1: schatten van multipliciteit met 4-Toegangspunt
	<ol>
<li>In spanning klem, houd de cel op-68 mV. Gebruikend de zelfde software, opnemen en de sEPSCs tegelijkertijd zoogdierlevercellen het bad met lage Ca2 + aCSF. Record voor ten minste 5 minuten na het begin van geheel-cel configuratie om een stabiele basislijn opname zoals de synaptische activiteit kan hoge kort na de doorbraak van het membraan.</li>
		<li>Met behulp van een micropipet, 4-AP toevoegen aan de aCSF en bad toepassing 30 µM 4-AP. Record sEPSCs voor ten minste 10 min. de volledige drug effect te verkrijgen.</li>
		<li>0,5 µM TTX en 10 µM Cd2 + toevoegen aan de aCSF met 4-AP en registreren van de mEPSCs voor ten minste 10 min.</li>
		<li>Gebruik de laatste 1 min van basislijn onmiddellijk voorafgaand aan het verzoek van 4-AP (in lage Ca2 + aCSF), de 10 min van 4-AP toepassing en de 10 min van TTX toepassing voor off line analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Experiment 2: desynchronize blaasje uitgave gebruikt Sr2 +
	<ol>
<li>Terwijl zoogdierlevercellen het bad met normale Ca2 + aCSF (hetzelfde als de aCSF bad) record sEPSCs voor minstens 5 min.</li>
		<li>Schakelen van de normale Ca2 + aCSF en beginnen zoogdierlevercellen Sr2 + aCSF (uit stap 1.4) en record sEPSCs.</li>
		<li>Vergelijk voor off line analyse, om te bepalen of de grote amplitude-sEPSCs door de synchrone vrijval van blaasjes, de laatste 1 min van de basislijn (in normale aCSF) tot de 10th minuut van Sr2 + aCSF-toepassing.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Experiment 3: test voor het gebruik van multivesicular versie Γ- DGG
	<ol>
<li>In lage Ca2 + aCSF record sEPSCs voor minstens 5 min.</li>
		<li>Voeg toe 30 µM 4-AP aan de aCSF via het systeem van de perfusie. Record sEPSCs voor ten minste 10 min.</li>
		<li>Toevoegen van 200 µM γ-DGG aan de aCSF met 4-AP en registreren van de sEPSCs voor ten minste 10 min.</li>
		<li>Als een controle-experiment in een aparte cel, uit te voeren stappen 1-3 maar toepassen een lage concentratie (125 nM) van DNQX in plaats van de γ-DGG.</li>
		<li>Voor off line analyse, analyseren de laatste min van de toepassing van elke drug.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Experiment 4: Stimuleren afferent ingangen te verhogen van de actiepotentiaal afvuren.
	<ol>
<li>Record sEPSCs in normale Ca2 + aCSF.</li>
		<li>Het stimuleren van de afferents met behulp van een monopolaire glaselektrode gevuld met aCSF met een snelheid van 20 Hz voor 2 s en herhaal 10 keer met een inter barsten interval van 20 sec.</li>
		<li>Voor analyse, de 5000 ms vóór de eerste prikkel gebruiken als de basislijn en vergelijken met de 10-300 ms na de laatste prikkel en neem dan de gemiddelde amplitude en frequentie verandering meer dan 10 proeven.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. analyse
<ol><li>SEPSCs en mEPSCs met behulp van een programma dat detecteert en analyseert synaptic stromingen (bijvoorbeeld Mini analyse software) analyseren.<ol>
<li>Gebruik van deze software, de voorgestelde detectie-parameters gebruiken voor het opsporen van AMPA Receptor EPSCs (of GABA Receptor-EPSCs als remmende stromingen van de opname).</li>
		<li>De Nonstop analyse functie gebruiken om te detecteren van EPSCs in de opname.</li>
		<li>Handmatig scannen van elke opname om ervoor te zorgen dat het programma is nauwkeurig het opsporen van elke gebeurtenis (bijvoorbeeld zorgen dat gebeurtenissen niet worden gemist of twee keer geteld).</li>
		<li>Exporteren van de gebeurtenisgegevens door deze te kopiëren naar het Klembord en plak deze in een data managementsoftware (bijvoorbeeld Excel)</li>
		<li>Berekenen van de gemiddelde frequentie en/of amplitude voor elke medicamenteuze behandeling en de relevante statistische analyses uit te voeren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, L. F., Nelson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity%3A+taming+the+beast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity: taming the beast.</a> Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).</li>
<li>Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Excitatory+Circuitry+in+the+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus.</a> Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).</li>
<li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li>
<li>Schrader, L. A., Tasker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+Modulation+by+Metabotropic+Glutamate+Receptors+of+Excitatory+and+Inhibitory+Synaptic+Inputs+to+Hypothalamic+Magnocellular+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527(1997).</li>
<li>Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+stress+dampens+excitatory+synaptic+gain+in+the+paraventricular+nucleus+of+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus.</a> The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).</li>
<li>Redman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+analysis+of+synaptic+potentials+in+neurons+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system.</a> Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).</li>
<li>Del Castillo, J., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+components+of+the+end-plate+potential%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Quantal components of the end-plate potential.</a> The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).</li>
<li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+release+of+neurotransmitter+and+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation.</a> Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).</li>
<li>Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spike-timing+dependence+of+structural+plasticity+explains+cooperative+synapse+formation+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex.</a> PLoS computational biology. 8 (9), e1002689(2012).</li>
<li>van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate%2C+the+dominant+excitatory+transmitter+in+neuroendocrine+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation.</a> Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).</li>
<li>Miklós, I. H., Kovács, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+synaptic+inputs+to+the+hypothalamic+paraventricular+nucleus+during+chronic+psychogenic+stress+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats.</a> Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).</li>
<li>Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKorn%2C+H+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 213 (4510), 898-901 (1981).</li>
<li>Tracey, D. J., Walmsley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+input+from+identified+muscle+afferents+to+neurones+of+the+dorsal+spinocerebellar+tract+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat.</a> The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).</li>
<li>Lin, J. W., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+mediated+by+single+club+endings+on+the+goldfish+Mauthner+cell.+II.+Plasticity+of+excitatory+postsynaptic+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).</li>
<li>Atwood, H. L., Tse, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+binomial+parameters+of+quantal+release+at+crustacean+motor+axon+terminals+during+presynaptic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition.</a> The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).</li>
<li>Li, G. L., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell%E2%80%99s+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li>
<li>Wadiche, J. I., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivesicular+release+at+climbing+fiber-Purkinje+cell+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses.</a> Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).</li>
<li>Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+control+of+quantal+size+by+synaptic+activity+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus.</a> Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).</li>
<li>Inoue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noradrenaline+is+a+stress-associated+metaplastic+signal+at+GABA+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses.</a> Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).</li>
<li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Brain+Slice+Methods+for+Adult+and+Aging+Animals%3A+Application+of+Targeted+Patch+Clamp+Analysis+and+Optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).</li>
<li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).</li>
<li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li>
<li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices%3A+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li>
<li>Gunn, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+astrocytic+and+synaptic+regulation+of+hypothalamic+glutamatergic+transmission+in+a+mouse+model+of+early-life+adversity%3A+relevance+to+neurosteroids+and+programming+of+the+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response.</a> Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).</li>
<li>Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+calcium+modulates+persistent+sodium+current-dependent+burst-firing+in+hippocampal+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).</li>
<li>Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+action+of+calcium+on+the+electrical+properties+of+squid+axons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">The action of calcium on the electrical properties of squid axons.</a> The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).</li>
<li>Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+Different+Slicing+Planes+in+Preservation+of+Major+Hippocampal+Pathway+Fibers+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse.</a> Frontiers in neuroanatomy. 11, 107(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Een belangrijke voorwaarde voor een succesvolle patch klem electrofysiologie experiment is het verkrijgen van gezonde segmenten/cellen. Ons beschreven protocol is geoptimaliseerd voor hypothalame segmenten die PVN neuronen bevatten. Andere hersenen gebieden mogelijk bewerkt oplossingen en snijden methoden21,22,23,24. Voor de opname, het is van cruciaal belang alleen te aanvaarden stabiele opnam...

Synaptische transmissie is een fundamenteel mechanisme voor de communicatie tussen de neuronen, en vandaar, hersenfunctie. Synaptische transmissie is ook labiele en haar werkzaamheid in een activiteit-afhankelijke manier zo goed zoals in reactie op f signalen1kunt wijzigen. Behandeling van synaptische functie is dus een belangrijke focus van het onderzoek neurowetenschap. Geheel-cel patch klem electrofysiologie is een veelzijdige techniek waarmee ons te begrijpen, bedenken experimentele designs en data-analyses, diepgaande biofysische en moleculaire mechanismen van synaptische transmissie. Een veel gebruikte aanpak, misschien vanwege de eenvoud van de techniek en concept, is het meten van miniatuur excitatory/remmende postsynaptisch stromen (mE / IPSCs) onder de spanning klem configuratie2,3, 4 , 5 , 6. afzonderlijke mPSCs vertegenwoordigen de stroom van ionen via postsynaptisch ionotropic receptoren (bijvoorbeeld AMPA en GABAA -receptoren) in reactie op de binding van hun respectieve neurotransmitters vrijgesteld van de presynaptische terminal 7 . Omdat de opname wordt verkregen in de aanwezigheid van de spanning-gated nb+ kanaal blocker tetrodotoxine (TTX), de release is actiepotentiaal-onafhankelijk en normaal impliceert een één synaptic blaasje met neurotransmitters. Op basis van deze veronderstelling, wordt de gemiddelde amplitude van de mPSCs veel gebruikt als een ruwe schatting voor de grootte van quantal, waarmee het aantal en de functionaliteit van postsynaptisch receptoren tegen een enkele release-site. Aan de andere kant, wordt de frequentie van de mPSCs geacht te vertegenwoordigen een combinatie van het totale aantal synapsen tot beëindiging op de postsynaptisch cel en de waarschijnlijkheid van hun gemiddelde release. Deze parameters meten echter niet een andere variabele-multiplicativity van synapsen of synaptic multipliciteit — dat is belangrijk voor de doeltreffendheid van synaptische transmissie.
Gebaseerd op de quantal theorie van synaptische transmissie7,8,9, de sterkte van een bepaalde verbinding tussen twee neuronen is afhankelijk van drie factoren: het aantal functionele synapsen (N), de postsynaptisch reactie op de release van een enkele synaptic blaasje (quantal grootte; Q) en de waarschijnlijkheid van neurotransmitter release (Pr). Synaptic multipliciteit is gelijk aan N. De ontwikkeling van synaptic multipliciteit of de sanering van de multiplicatieve synapsen is kunststof in ontwikkeling en in andere ziekte staten3,4,6,10. Om deze reden heeft karakteriseren van synaptic multipliciteit belangrijke implicaties voor het begrijpen van de werkzaamheid van synaptische transmissie bij gezondheid en ziekte. Technieken, zoals elektronenmicroscopie kunnen structurele bewijs van synaptic multipliciteit herkennen door het detecteren van meerdere synaptic contactpersonen die afkomstig zijn uit de dezelfde axon op de dezelfde postsynaptisch neuron11,12, 13,14. Deze structureel geïdentificeerde multisynapses kunnen echter functioneel stille15,16. Precieze functionele behandeling van N meebrengt dat technisch uitdagende elektrofysiologische benaderingen, zoals gepaarde geheel-cel opnames die vaststellen kunnen of een bepaalde verbinding meerdere functionele release sites heeft en minimale stimulatie benaderingen die gericht zijn op het werven van een enkele vermeende axon.
In dit protocol beschrijven we een eenvoudige methode voor het schatten van synaptic multipliciteit door het aannemen van een methode die oorspronkelijk ontwikkeld door Hsia et al.2. Deze techniek omvat het meten van de spontane PSC's (sPSCs) en mPSCs met behulp van geheel-cel patch klem electrofysiologie, waardoor we de mate van synaptic multipliciteit schatten van alle ingangen naar een bepaalde neuron.  Zoals eerder omschreven, synaptic multipliciteit het aantal synapsen tussen een bepaalde pre-en postsynaptisch neuron geeft. Als meerdere synapsen worden gerekruteerd in synchronie door een actiepotentiaal, zal er een hoge waarschijnlijkheid van temporele sommatie van individuele (d.w.z. quantal) PSC, het genereren van een grotere amplitude PSC.  In mPSC-opnamen (in welke actie potentials worden geblokkeerd door TTX), de waarschijnlijkheid van temporele sommatie van afzonderlijke (niet-synchrone) mPSCs is laag. Met behulp van deze grondgedachte, kan synaptic multipliciteit worden geschat door het vergelijken van de amplitude van de sPSC (met actiepotentiaal-afhankelijke versie) met de amplitude van de mPSC.
Onderzoek naar het bestaan van multipliciteit beschrijven we vier experimenten en hun analyses met behulp van glutamaterge EPSCs als voorbeeld. Dezelfde aanpak kan echter worden gebruikt voor de snelle toezending van de GABAergic/glycinergic (IPSCs). Een korte motivering van elk experiment wordt hieronder beschreven. Eerst, zoals hierboven uitgelegd, synaptic multipliciteit kan worden geschat door het vergelijken van de amplitude van de sEPSCs te mEPSCs. Er zijn twee vereisten voor deze aanpak; 1) presynaptische axonen moeten een voldoende aantal actie potentials brand tijdens de opname, en 2) Pr moet hoog zijn, zodat meerdere synapsen release neurotransmitter bij binnenkomst van een actiepotentiaal. Om aan deze eisen voldoen, worden sEPSCs eerst geregistreerd in lage Ca2 + kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF), en vervolgens opgenomen in de aanwezigheid van een lage concentratie van de K+ kanaal antagonist, 4-Aminopyridine (4-AP) toe actie potentiële afvuren en Pr. Actiepotentiaal afvuren wordt dan geblokkeerd door TTX en Pr daalde met een spanning-gated Ca2 + kanaal blocker Cd2 +. De amplitude van de sEPSCs (met 4AP) wordt vergeleken met die van mEPSC (met 4AP, TTX en Cd2 +). In het tweede experiment, is Ca2 + vervangen door mengsel Sr2 + in de aCSF te desynchronize blaasje release. Als Ca2 + vereist voor de synchrone release van blaasjes is, moet vervanging met Sr2 + de grote amplitude-sEPSCs die indicatief voor multipliciteit zijn elimineren. Ten derde, mechanistically, multipliciteit kan voortvloeien uit meerdere synaptic contactpersonen de dezelfde postsynaptisch neuron of multivesicular release (dat wil zeggen meerdere blaasjes vrijgegeven binnen een synaptic éénloket)17,18. Om te differentiëren tussen de twee soorten multipliciteit, het derde experiment maakt gebruik van een lage affiniteit, snelle distantieert concurrerende antagonist van AMPA receptoren, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 , om te bepalen of grote sEPSC zijn het resultaat van de temporele sommatie van onafhankelijke synapsen of multivesicular release op een overlappende bevolking van postsynaptisch receptoren. Als de grote amplitude gebeurtenissen ontstaan uit multivesicular release, zullen γ-DGG minder effectief op remming van de grotere ten opzichte van kleinere sEPSCs, overwegende dat de grote sEPSCs die uit de tijdelijke sommatie van meerdere synaptic contactpersonen voortvloeien op dezelfde manier zal worden beïnvloed door Γ-DGG. In het vierde experiment, wordt een meer fysiologische methode gebruikt ter verbetering van de actiepotentiaal afvuren, namelijk afferent synaptic stimulatie. Uitbarstingen van synaptic activiteit kunnen Transient verhoging/vergemakkelijken de spontane actiepotentiaal afvuren en release kans de afferents gestimuleerd. Deze benadering biedt daarom multipliciteit om in een meer fysiologische manier te manifesteren.
Het volgende protocol beschrijft de methode voor het uitvoeren van deze experimenten in muis hypothalame weefsel. In het bijzonder worden corticotropin releasing hormoon (CRH) neuronen van de kern van de paraventricular van de hypothalamus (PVN) gebruikt. We beschrijven de procedures voor het uitvoeren van geheel-cel patch klem elektrofysiologie en de specifieke experimenten om te testen voor synaptic multipliciteit te verklaren.

<table><tbody><tr><td>1 mL-spuit</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mes</td><td>Fisher Scientific/anderen</td><td>35698</td><td></td></tr><tr><td>22 mes</td><td>VWR/anderen</td><td>21909-626</td><td></td></tr><tr><td>22 &mu;M-spuitfilters</td><td>Milipore</td><td>09-719-000</td><td></td></tr><tr><td>Adson pincet</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8547</td><td></td></tr><tr><td>Scherpe schuine schaar</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8437</td><td></td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10</td><td></td></tr><tr><td>Dubbelzijdig mes</td><td>VWR</td><td>74-0002</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Sigma/anderen</td><td>1001090</td><td></td></tr><tr><td>Fijne schilderskwast</td><td>Fisher/verschillende</td><td>15-183-35/verschillende</td><td></td></tr><tr><td>Gasdispersieslang</td><td>VWR</td><td>LG-8680-120</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Fresenius Kabi/anderen</td><td>M60303</td><td></td></tr><tr><td>Krazy lijm</td><td>verschillende</td><td>verschillende</td><td></td></tr><tr><td>Mini analyse</td><td>Synaptosoft</td><td>MiniAnalysis 6</td><td></td></tr><tr><td>Osmomètre</td><td>Wescor Inc</td><td>Model 5600</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipet</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Mettler Toledo</td><td>FE20-ATC</td><td></td></tr><tr><td>Rubberen bulb</td><td>VWR</td><td>82024-550</td><td></td></tr><tr><td>Scalpelhandgreep nr. 3</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8350</td><td></td></tr><tr><td>Scalpelhandgreep nr. 4</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8356</td><td></td></tr><tr><td>Eénzijdig mes</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Vibratomesnijder</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Waterzuiveringssysteem</td><td>Millipore</td><td>Milli-Q Academic A10</td><td></td></tr><tr><td>Welplatendeksel</td><td>Fisher/verschillende</td><td>07-201-590/verschillende</td><td></td></tr><tr><td>Chemicaliën/reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-AP</td><td>Sigma</td><td>275875</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>molecular probes</td><td>B1204</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2*2H2O</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>CdCl2</td><td>sigma</td><td>202908</td><td></td></tr><tr><td>DNQX</td><td>Tocris</td><td>189</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>K2-ATP</td><td>Sigma</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconaat</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2*6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Water van moleculaire biologiekwaliteit</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.1</td><td></td></tr><tr><td>Na-gluconaat</td><td>Sigma</td><td>S2054</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>71504</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxine</td><td>sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>SrCl</td><td>Sigma</td><td>255521</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Bioshop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Alamone Labs</td><td>T-550</td><td></td></tr><tr><td>yDGG</td><td>Tocris</td><td>6729-55-1</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluatie van synaptic multipliciteit met behulp van geheel-cel patch-clamp electrofysiologie

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

In het centrale zenuwstelsel, een paar van neuronen vaak vormen meerdere synaptic contacten en/of functionele neurotransmitter release sites (synaptic multipliciteit). Synaptic multipliciteit is plastic en veranderingen in de gehele ontwikkeling en in de verschillende fysiologische omstandigheden, wordt een belangrijke determinant voor de werkzaamheid van synaptische transmissie. We schetsen hier, experimenten voor het inschatten van de mate van multipliciteit van synapsen eindigt op een bepaalde postsynaptisch neuron geheel-cel patch klem electrofysiologie met acute hersenen segmenten. Specifiek, wordt spanning-clamp opname gebruikt voor het vergelijken van het verschil tussen de amplitude van spontane excitatory postsynaptisch stromingen (sEPSCs) en miniatuur excitatory postsynaptisch stromingen (mEPSCs). De theorie achter deze methode is dat afferent "inputs" die veelheid vertonen grote, actiepotentiaal-afhankelijke sEPSCs als gevolg van de synchrone release die bij elke synaptic contactpersoon optreedt zal tonen. Daarentegen zal de actiepotentiaal-zelfstandige release (die asynchroon is) kleinere amplitude mEPSCs genereren. Dit artikel schetst een aantal experimenten en analyses te karakteriseren van het bestaan van synaptic multipliciteit en bespreekt de vereisten en beperkingen van de techniek. Deze techniek kan worden toegepast om te onderzoeken hoe verschillende gedrags-, farmacologische of milieu interventies in vivo invloed op de organisatie van synaptic contactpersonen in verschillende hersengebieden.

Het bovenstaande protocol beschrijft een methode voor het gebruik van geheel-cel patch klem electrofysiologie te onderzoeken van de mate van synaptic multipliciteit, met behulp van de muis hypothalame neuronen als voorbeeld. Dit segment voorbereiding techniek moet opleveren gezonde levensvatbare cellen die geen een gezwollen membraan of de nucleus (Figuur 1). Elke stap in het protocol is belangrijk voor de gezondheid van het weefsel en de kwaliteit van de opnamen.
<p ...

Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de functionele synaptic multipliciteit geheel-cel patch klem electrofysiologie met acute hersenen segmenten.

Evaluatie van Synaptic multipliciteit met behulp van geheel-cel Patch-clamp electrofysiologie

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

In de hersenen vormen een paar neuronen vaak meerdere synaptische contacten, die synaptische multipliciteit worden genoemd. Echter, nauwkeurig onderzoek van synaptische multipliciteit vereist technisch uitdagende experimenten. Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode voor grove schatting van synaptische multipliciteit met behulp van hele-cel patch-klem elektrofysiologie.Deze methode kan worden toegepast op elke soort en hersenen gebied om synaptische multipliciteit te onderzoeken. Deze methode vereist basisvaardigheden in hele-cel patch-clamp elektrofysiologie. Het verkrijgen van hoogwaardige opnames met een lage en stabiele toegangsweerstand is essentieel voor de nauwkeurige interpretatie van de gegevens.Om de hele celconfiguratie te verkrijgen, plaatst u de opnamepipet net boven het segment en offset pipetstroom in de spanningsklemmodus. Breng lichte positieve druk op de pipet aan en vergrendel de stopcock. Selecteer vervolgens een gezonde cel met een intact membraan en benader het weefsel met de pipet.De positieve druk moet een lichte verstoring van het weefsel veroorzaken. Breng de pipet langzaam dichter bij de cel in een diagonale beweging totdat een klein kuiltje wordt gevormd op het celoppervlak. Laat vervolgens het positieve drukslot los.De cel zal beginnen om een verbinding te vormen, en de weerstand zal toenemen boven een gigaohm. Houd de cel in spanningsklem op min 68 millivolt. Trek vervolgens de pipet diagonaal van de cel weg om overtollige druk te verwijderen.Compenseer de snelle en langzame pipetcapaciteit. Breng een korte zuigkracht aan door de buis die op de pipethouder is aangesloten om door de cel te breken en een geheelcellige configuratie te verkrijgen. Schakel vervolgens over naar de celmodus op het membraantestvenster in een software voor het verwerven en analyseren van elektrofysiologiegegevens.Houd de temperatuur van het opnamebad op 27 tot 30 graden Celsius en de stroomsnelheid op 1,5 tot twee milliliter per minuut voor latere experimenten. In een multipliciteit synaps, een actie potentieel synchroniseert neurotransmitter release en genereert een grotere postsynaptische stroom. Het blokkeren van actiepotentieel en calciumafhankelijke vesiculaire afgifte met TTX en cadmium voorkomt de postsynaptische stroomschomming en vermindert de amplitude.Wanneer er geen veelheid is, zal het blokkeren van actiepotentieel de amplitude niet veranderen. In experiment één, om multipliciteit te schatten, houdt de cel bij min 68 millivolt terwijl het met laag-calcium aCSF doordringt. Neem de spontane EPSCs gedurende ten minste vijf minuten op om een stabiele basislijn te garanderen.Voeg vervolgens 30 micromolars 4-AP toe aan het aCSF om potentiële gebeurtenissen te verhogen en neem spontane EPSCs gedurende ten minste 10 minuten op om het volledige medicijneffect te verkrijgen. Voeg vervolgens 0,5 micromolars TTX en 10 micromolars cadmium toe aan de aCSF met 4-AP en neem de miniatuur EPSCs minstens 10 minuten op. Voor offline analyse gebruikt u de laatste minuut van de basislijn vlak voor de toepassing van 4-AP, de 10e minuut van de 4-AP-toepassing en de 10e minuut van de TTX-toepassing.In dit experiment wordt extracellulair calcium vervangen door strontium om het vrijkomen van synaptische vikjes te desynchroniseren. Daarom, als multipliciteit aanwezig is, moet dit de amplitude van postsynaptische stromingen verminderen. In experiment twee, opnemen spontane EPSCs gedurende ten minste vijf minuten, terwijl perfusing de cel met normale calcium aCSF.Om vesicle-release te desynchroniseren, begint u met het doordrenen van de cel met strontium aCSF en neem u spontane EPSCs op. Voor offline analyse, om te bepalen of de grote amplitude spontane EPSCs zijn te wijten aan de synchrone release van vesicles, vergelijk de laatste minuut van de basislijn tot de 10e minuut van strontium aCSF applicatie. Multipliciteit kan multivesiculaire afgifte, die hogere neurotransmitter concentratie in de synaptische spleet veroorzaakt.Toevoeging van gamma-DGG, een low-affinity AMPA receptor antagonist, leidt tot minder effectieve remming van grotere multiquantal in vergelijking met kleinere uniquantal postsynaptische stromen. Zonder multivesiculaire release zal gamma-DGG even effectief zijn op grotere en kleinere postsynaptische stromingen. In experiment drie, om te testen op multivesiculaire release, opnemen spontane EPSCs in laag calcium aCSF gedurende ten minste vijf minuten.Voeg 30 micromolars 4-AP toe aan het aCSF via het perfusiesysteem. Neem de spontane EPSCs gedurende ten minste 10 minuten op. Voeg vervolgens 200 micromolars gamma-DGG toe aan de aCSF met 4-AP en neem de spontane EPSCs gedurende ten minste 10 minuten op.Herhaal als controle-experiment in een aparte cel de procedures, maar pas een lage concentratie van DNQX toe in plaats van gamma-DGG. Voor offline analyse analyseert u de laatste minuut van elke medicijntoepassing. Uitbarstingen van synaptische activiteit kunnen tijdelijk verhogen spontane actie potentiële vuren en release waarschijnlijkheid van de gestimuleerde afferents.Als neuronen vertonen multipliciteit, de toename van de actie potentialen moet leiden tot een tijdelijke toename van de amplitude van postsynaptische stromingen. In experiment vier, opnemen spontane EPSCs in normale calcium aCSF. Om het werkingspotentieel te verhogen, stimuleert u de afferents met behulp van een monopolaire glazen elektrode gevuld met aCSF met een snelheid van 20 hertz gedurende twee seconden en herhaal deze 10 keer met een inter-burst interval van 20 seconden.Voor analyse gebruikt u 5,000 milliseconden spontane EPSCs vóór de eerste stimulus als basislijn en vergelijk deze met de spontane EPSCs van 10 tot 300 milliseconden na de uiteindelijke stimulus. Neem vervolgens de gemiddelde amplitude en frequentieverandering over 10 proeven. Analyseer spontane EPSCs en miniatuur EPSCs met behulp van een programma dat synaptische stromen detecteert en analyseert.Gebruik de voorgestelde detectieparameters en non-stop analysefunctie voor het detecteren van AMPA-receptorgemedieerde EPSCs. Scan elke opname handmatig om ervoor te zorgen dat het programma elke gebeurtenis nauwkeurig detecteert. Exporteer de gebeurtenisgegevens door deze naar het klembord te kopiëren en plak deze in een gegevensbeheersoftware.Bereken vervolgens de gemiddelde frequentie en amplitude voor elke medicijnbehandeling en voer de relevante statistische analyses uit. In een voorbeeld dat hier wordt getoond, verhoogt 4-AP zowel de amplitude als de frequentie van spontane EPSCs. De latere toepassing van TTX en cadmium vermindert zowel de amplitude als de frequentie.Hier is de distributie van spontane EPSC amplitude van de opname. In de hier onderzochte hypothalamische neuronen zijn de amplitude en frequentie van de basislijn en TTX-omstandigheden hetzelfde, wat suggereert dat de spontane uitgangslijn EPSCs zeer weinig actiepotentieelafhankelijke EPSCs bevatten. Bijgevolg kunnen latere experimenten het verschil tussen baseline en 4-AP vergelijken om de veelheid te meten.De sterkte van synaptische transmissie kan tijdelijk worden verhoogd door uitbarstingen van synaptische activiteit. Om multipliciteit onder meer fysiologische omstandigheden te onderzoeken, kan afferente stimulatie worden gebruikt om de werking te verhogen potentiële vuren en release waarschijnlijkheid. Hier zijn de samenvattingen van spontane EPSC frequentie en amplitude veranderingen na synaptische stimulatie.Stabiele opnames zijn essentieel voor een nauwkeurige interpretatie van de gegevens. Beschrijf de gegevens als de toegangsweerstand tijdens de opname met meer dan 20% verandert, omdat dit de analyse kan verstoren. Dit protocol biedt een eenvoudige manier om synaptische multipliciteit te schatten, wat een belangrijke determinant is van synaptische werkzaamheid en de plasticiteit ervan in verschillende fysiologische en pathofysiologische omstandigheden.

evaluation-synaptic-multiplicity-using-whole-cell-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft een techniek genaamd whole-cell patch clamp electrophysiology, een methode om elektrische eigenschappen van Mauthner neuronen en andere reticulospinale cellen in zebravisembryo's te bestuderen.

Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: een methode om elektrische eigenschappen van neuronen te bestuderen

This video demonstrates the whole-cell patch clamp technique in a mouse brain slice. This technique establishes a stable connection between micropipette and neuron membrane, which is further disrupted to establish a whole-cell configuration to study the neuron's health and physiological responses.

Establishing a Whole-Cell Configuration through the Patch Clamp Method

The video demonstrates a method to study the excitability of neuronal cells expressing fluorescent protein using a whole-cell patch current clamp. In the current-clamp mode, action potentials indicative of neuronal excitability are generated.

Studying the Excitability of Fluorescent Neurons using a Whole-Cell Patch Clamp

This video demonstrates positioning a fine-pointed pipette near brain slices, forming a seal with a neuronal cell. Suction breaks the cell membrane, thereby creating a whole-cell patch clamp that enables current measurements for electrophysiology experiments.

Establishing a Whole-Cell Voltage-Clamp Configuration for Electrophysiological Recordings in Brain Slices

Multi-elektrode patch-clamp vormen een complexe taak. Hier laten we zien hoe, door het automatiseren van veel van de experimentele stappen is het mogelijk om het proces dat tot kwalitatieve verbetering van de prestaties en het aantal opnamen versnellen.

Een Computer-assisted Multi-elektrode Patch-clamp System

Corticale netwerken worden gecontroleerd door een kleine, maar gevarieerde set van remmende interneuronen. Functioneel onderzoek van interneuronen vereist daarom gerichte opname en strenge identificatie. Hier beschreven is een gecombineerde aanpak met whole-cell opnames van enkele of synaptically gekoppelde paren van neuronen met intracellulaire etikettering, post-hoc-morfologische en immunocytochemische analyse.

Whole-cell patch-clamp opnamen van Morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus Interneurons

Paaropnamen zijn gelijktijdige gehele cel patch clamp opnamen van twee synaptisch verbonden neuronen, waardoor een nauwkeurige elektrofysiologische en farmacologische karakterisering van de synapsen tussen individuele neuronen mogelijk wordt. Hier beschrijven we de gedetailleerde methodologie en vereisten voor het vestigen van deze techniek in organotypische hippocampale plakculturen in elk laboratorium dat is uitgerust voor elektrofysiologie.

Gepaarde Whole Cell Opnamen in Organotypische hippocampus Slices

Patch-clamp opnames en gelijktijdige intracellulaire biocytinevulling van synaptisch gekoppelde neuronen in acute herfsneden maken een gecorreleerde analyse van hun structurele en functionele eigenschappen mogelijk. Het doel van dit protocol is om de essentiële technische stappen van elektrofysiologisch opnemen van neuronale microcircuits en hun daaropvolgende morfologische analyse te beschrijven.

Elektrofysiologische en morfologische analyse van neuronale Microschake in Acute Brain Slices Met behulp Paired Patch-Clamp Recordings

Dit protocol beschrijft elementaire procedurele stappen voor het uitvoeren van whole-cell patch-clamp opnames. Deze techniek maakt het onderzoek mogelijk van het elektrisch gedrag van neuronen, en wanneer uitgevoerd in hersencoupes, kan worden nagegaan of verschillende neuronale functies van neuronen die nog geïntegreerd in goed behouden hersenen circuits.

Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Het segment patch-clamp techniek is een effectieve methode voor het analyseren van leren-geïnduceerde veranderingen in de intrinsieke eigenschappen en de plasticiteit van excitatory of inhiberende synapsen.

Segment Patch-Clamp techniek voor het analyseren van leren-Induced Plasticity

Leer synaptische multipliciteit evalueren in neuronen met behulp van whole-cell patch-clamp elektrofysiologie op acute hersensneden. Deze methode biedt inzicht in synaptische transmissie en neurale communicatie.

Evaluatie van Synaptic multipliciteit met behulp van geheel-cel Patch-clamp electrofysiologie

Meer video's verkennen