Evaluatie van Synaptic multipliciteit met behulp van geheel-cel Patch-clamp electrofysiologie

In de hersenen vormen een paar neuronen vaak meerdere synaptische contacten, die synaptische multipliciteit worden genoemd. Echter, nauwkeurig onderzoek van synaptische multipliciteit vereist technisch uitdagende experimenten. Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode voor grove schatting van synaptische multipliciteit met behulp van hele-cel patch-klem elektrofysiologie.

Deze methode kan worden toegepast op elke soort en hersenen gebied om synaptische multipliciteit te onderzoeken. Deze methode vereist basisvaardigheden in hele-cel patch-clamp elektrofysiologie. Het verkrijgen van hoogwaardige opnames met een lage en stabiele toegangsweerstand is essentieel voor de nauwkeurige interpretatie van de gegevens.

Om de hele celconfiguratie te verkrijgen, plaatst u de opnamepipet net boven het segment en offset pipetstroom in de spanningsklemmodus. Breng lichte positieve druk op de pipet aan en vergrendel de stopcock. Selecteer vervolgens een gezonde cel met een intact membraan en benader het weefsel met de pipet.

De positieve druk moet een lichte verstoring van het weefsel veroorzaken. Breng de pipet langzaam dichter bij de cel in een diagonale beweging totdat een klein kuiltje wordt gevormd op het celoppervlak. Laat vervolgens het positieve drukslot los.

De cel zal beginnen om een verbinding te vormen, en de weerstand zal toenemen boven een gigaohm. Houd de cel in spanningsklem op min 68 millivolt. Trek vervolgens de pipet diagonaal van de cel weg om overtollige druk te verwijderen.

Compenseer de snelle en langzame pipetcapaciteit. Breng een korte zuigkracht aan door de buis die op de pipethouder is aangesloten om door de cel te breken en een geheelcellige configuratie te verkrijgen. Schakel vervolgens over naar de celmodus op het membraantestvenster in een software voor het verwerven en analyseren van elektrofysiologiegegevens.

Houd de temperatuur van het opnamebad op 27 tot 30 graden Celsius en de stroomsnelheid op 1,5 tot twee milliliter per minuut voor latere experimenten. In een multipliciteit synaps, een actie potentieel synchroniseert neurotransmitter release en genereert een grotere postsynaptische stroom. Het blokkeren van actiepotentieel en calciumafhankelijke vesiculaire afgifte met TTX en cadmium voorkomt de postsynaptische stroomschomming en vermindert de amplitude.

Wanneer er geen veelheid is, zal het blokkeren van actiepotentieel de amplitude niet veranderen. In experiment één, om multipliciteit te schatten, houdt de cel bij min 68 millivolt terwijl het met laag-calcium aCSF doordringt. Neem de spontane EPSCs gedurende ten minste vijf minuten op om een stabiele basislijn te garanderen.

Voeg vervolgens 30 micromolars 4-AP toe aan het aCSF om potentiële gebeurtenissen te verhogen en neem spontane EPSCs gedurende ten minste 10 minuten op om het volledige medicijneffect te verkrijgen. Voeg vervolgens 0,5 micromolars TTX en 10 micromolars cadmium toe aan de aCSF met 4-AP en neem de miniatuur EPSCs minstens 10 minuten op. Voor offline analyse gebruikt u de laatste minuut van de basislijn vlak voor de toepassing van 4-AP, de 10e minuut van de 4-AP-toepassing en de 10e minuut van de TTX-toepassing.

In dit experiment wordt extracellulair calcium vervangen door strontium om het vrijkomen van synaptische vikjes te desynchroniseren. Daarom, als multipliciteit aanwezig is, moet dit de amplitude van postsynaptische stromingen verminderen. In experiment twee, opnemen spontane EPSCs gedurende ten minste vijf minuten, terwijl perfusing de cel met normale calcium aCSF.

Om vesicle-release te desynchroniseren, begint u met het doordrenen van de cel met strontium aCSF en neem u spontane EPSCs op. Voor offline analyse, om te bepalen of de grote amplitude spontane EPSCs zijn te wijten aan de synchrone release van vesicles, vergelijk de laatste minuut van de basislijn tot de 10e minuut van strontium aCSF applicatie. Multipliciteit kan multivesiculaire afgifte, die hogere neurotransmitter concentratie in de synaptische spleet veroorzaakt.

Toevoeging van gamma-DGG, een low-affinity AMPA receptor antagonist, leidt tot minder effectieve remming van grotere multiquantal in vergelijking met kleinere uniquantal postsynaptische stromen. Zonder multivesiculaire release zal gamma-DGG even effectief zijn op grotere en kleinere postsynaptische stromingen. In experiment drie, om te testen op multivesiculaire release, opnemen spontane EPSCs in laag calcium aCSF gedurende ten minste vijf minuten.

Voeg 30 micromolars 4-AP toe aan het aCSF via het perfusiesysteem. Neem de spontane EPSCs gedurende ten minste 10 minuten op. Voeg vervolgens 200 micromolars gamma-DGG toe aan de aCSF met 4-AP en neem de spontane EPSCs gedurende ten minste 10 minuten op.

Herhaal als controle-experiment in een aparte cel de procedures, maar pas een lage concentratie van DNQX toe in plaats van gamma-DGG. Voor offline analyse analyseert u de laatste minuut van elke medicijntoepassing. Uitbarstingen van synaptische activiteit kunnen tijdelijk verhogen spontane actie potentiële vuren en release waarschijnlijkheid van de gestimuleerde afferents.

Als neuronen vertonen multipliciteit, de toename van de actie potentialen moet leiden tot een tijdelijke toename van de amplitude van postsynaptische stromingen. In experiment vier, opnemen spontane EPSCs in normale calcium aCSF. Om het werkingspotentieel te verhogen, stimuleert u de afferents met behulp van een monopolaire glazen elektrode gevuld met aCSF met een snelheid van 20 hertz gedurende twee seconden en herhaal deze 10 keer met een inter-burst interval van 20 seconden.

Voor analyse gebruikt u 5,000 milliseconden spontane EPSCs vóór de eerste stimulus als basislijn en vergelijk deze met de spontane EPSCs van 10 tot 300 milliseconden na de uiteindelijke stimulus. Neem vervolgens de gemiddelde amplitude en frequentieverandering over 10 proeven. Analyseer spontane EPSCs en miniatuur EPSCs met behulp van een programma dat synaptische stromen detecteert en analyseert.

Gebruik de voorgestelde detectieparameters en non-stop analysefunctie voor het detecteren van AMPA-receptorgemedieerde EPSCs. Scan elke opname handmatig om ervoor te zorgen dat het programma elke gebeurtenis nauwkeurig detecteert. Exporteer de gebeurtenisgegevens door deze naar het klembord te kopiëren en plak deze in een gegevensbeheersoftware.

Bereken vervolgens de gemiddelde frequentie en amplitude voor elke medicijnbehandeling en voer de relevante statistische analyses uit. In een voorbeeld dat hier wordt getoond, verhoogt 4-AP zowel de amplitude als de frequentie van spontane EPSCs. De latere toepassing van TTX en cadmium vermindert zowel de amplitude als de frequentie.

Hier is de distributie van spontane EPSC amplitude van de opname. In de hier onderzochte hypothalamische neuronen zijn de amplitude en frequentie van de basislijn en TTX-omstandigheden hetzelfde, wat suggereert dat de spontane uitgangslijn EPSCs zeer weinig actiepotentieelafhankelijke EPSCs bevatten. Bijgevolg kunnen latere experimenten het verschil tussen baseline en 4-AP vergelijken om de veelheid te meten.

De sterkte van synaptische transmissie kan tijdelijk worden verhoogd door uitbarstingen van synaptische activiteit. Om multipliciteit onder meer fysiologische omstandigheden te onderzoeken, kan afferente stimulatie worden gebruikt om de werking te verhogen potentiële vuren en release waarschijnlijkheid. Hier zijn de samenvattingen van spontane EPSC frequentie en amplitude veranderingen na synaptische stimulatie.

Stabiele opnames zijn essentieel voor een nauwkeurige interpretatie van de gegevens. Beschrijf de gegevens als de toegangsweerstand tijdens de opname met meer dan 20% verandert, omdat dit de analyse kan verstoren. Dit protocol biedt een eenvoudige manier om synaptische multipliciteit te schatten, wat een belangrijke determinant is van synaptische werkzaamheid en de plasticiteit ervan in verschillende fysiologische en pathofysiologische omstandigheden.