Implementatie van een niet-lineaire Microscoop op basis van gestimuleerde Raman verstrooiing

Dit protocol kan wetenschappers die geïnteresseerd zijn in niet-lineaire microscopie helpen om de belangrijkste componenten, het opzetten en de uitlijningsprocedure van een microscoop op basis van gestimuleerde Raman-verstrooiing te begrijpen. De belangrijkste voordelen van SRS-microscopie zijn de mogelijkheden om labelvrije beeldvorming uit te voeren op basis van trillingscontrast en om binnen enkele seconden een beeld te verwerven. SRS microscopie heeft genomen label-vrije beeldvorming naar nieuwe hoogten vooral studies van complexe biologische structuren zoals lipiden, die fundamenteel zijn voor cellen en cellulaire architectuur.

SRS signaal wordt gedetecteerd als een kleine verandering in de intensiteit van de sonde straal en het kan worden beschadigd door ruis. Daarom is een nauwkeurig teken cruciaal. Om te beginnen, lijn de OPO en de Titanium-saffier laserstralen, zodat ze beide de microscoop te bereiken.

Plaats vervolgens de detectoren van de laserstraalpositiesensor in twee standen tussen de dichroic mirror one en spiegel zes. De eerste positie bevindt zich dicht bij dichroic spiegel één en de tweede is dicht bij spiegel zes. Gebruik voor elke positie de sensoren om de X- en Y-coördinaten van de OPO-straal te detecteren.

Belangrijk is dat de X- en Y-coördinaten van de Titanium-saffierlaserstraal in beide posities van de detectoren van de sensor van dezelfde OPO zijn. Als, in sommige posities, de coördinaten niet samenvallen, stem dan de kanteling van de aangrenzende spiegel af om te compenseren. Volg dezelfde procedure om de Titanium-saffierbalkposities ten opzichte van OPO uit te lijnen voor het pad tussen de zes en zeven spiegel.

Installeer een extra spiegel op een flip-flop mount in-tussen spiegel zes en zeven en flip de berg van de spiegel om de balk direct in de autocorrelatie. Power op de autocorrrelator controller, start de software-applicatie op de computer die het bestuurt, en stel de bundel afstand aanpassing schroef van de autocorrrelator op zijn normale positie op 8,35 millimeter. Stop vervolgens de Titanium-saffierbalk en laat de OPO-balk los van de extra spiegel naar de ingangsspiegel van de autocoreerder.

Probeer de ingangsspiegel aan te passen om het laserpulssignaal te maximaliseren, zoals hier wordt weergegeven. Stop vervolgens de OPO-balk en laat de Titanium-sapphire balk los van de flip-flop gemonteerde spiegel naar de ingangsspiegel en in de autocorrelatieator. Herhaal de optimale bundelverstelling totdat het hier getoonde autocorrelatiesignaalsignaal is verkregen.

Stel nu de balkafstandverstellingsschroef in op de kruispositie op 7,30 millimeter. Laat beide balken los en scan de vertraagde lijn om de twee balken te overlappen. Verkrijg resulterend cross-correlator signaal, zoals hier getoond.

Draai vervolgens de flip-flop gemonteerde spiegel, zodat de balken kunnen bereiken spiegel zeven en de scan hoofd van de microscoop. Verwijder de condensor en gebruik de ontsnappingsknop om de 60x subjectieve lens tijdelijk in te trekken. Draai vervolgens de neus-stuk om de 60x subjectieve lens te verplaatsen van het optische pad.

Monteer vervolgens de detector aan het bovenste deel van de microscoop met behulp van de externe mechanische bevestiging. Sluit de output van de detector via een 50 Ohm Low Pass Filter aan op een oscilloscoop. Zet nu de processor aan die de scannerkop bestuurt en projecteer de OPO-straal in de scannerkop van de microscoop.

Controleer het OPO-signaal en maximaliseer het door de detector gemeten vermogen met behulp van een XY-vertaler. Schakel vervolgens de straal van de OPO-laser in op de Titanium-sapphire laser en controleer of er ook een signaal wordt verkregen voor de Titanium-sapphire laser. Dit geeft aan dat beide balken goed zijn uitgelijnd.

Rond de bundel uitlijning door het draaien terug de neus-stuk om de 60x subjectief te introduceren. Gebruik vervolgens de refocus-knop op de microscoop om de definitieve focus op de 60x microscoop objectieve lens te herwinnen. Plaats ten slotte het doel, met een vergroting van 40x, in plaats van de condensor zonder het monster aan te raken of te verstoren.

Stel de kracht van de Titanium-sapphire en OPO lasers gemeten voor de microscoop op 30 milliwatt voor beide balken. Stel vervolgens de golflengte van de OPO-laser in op een andere waarde, ten opzichte van de vorige, zodat de pomp en sonde niet in resonantie zijn met de trillingsfrequentie van de kralen. Laat vervolgens beide balken los, zodat ze in de microscoop terechtkomen.

Voer de computervertaler voor scanvertragingslijn uit en noteer de gemeten intensiteit met behulp van de lock-in versterker voor elke positie van de vertragingslijn. Wacht tot het scannen van de vertragingslijn is voltooid. Stel nu de golflengte van de OPO terug op 1076 nanometer, zodat de pomp en sonde resonantie zijn met de trillingsfrequentie van de kralen.

Voer de computervertaler voor het scannen van vertragingslijn uit en wacht tot het scannen van de vertragingslijn is voltooid. Ten slotte, stel de verkregen overlappende bundel positie en de vertraging lijn voor de volgende verwerving van gestimuleerd Raman verstrooiing beelden. Om de ruimtelijke synchronisatie van de balken te optimaliseren, begint u met het stoppen van de Titanium-saffierbalk en het verminderen van het OPO-vermogen tot acht milliwatt.

Sluit vervolgens de uitlezing van de detector aan op de gegevensacquisitiekaart. Voer het data-acquisitieprogramma samen met de microscoopscanconsole uit. Sla het bestand op en verwerkt de gegevens om een afbeelding te krijgen zoals hier wordt weergegeven.

Stop vervolgens de OPO-balk en verlaag het Titanium-saffiervermogen tot 2,5 tot 4,5 milliwatt. Sluit de detector aan met de lock-in versterker en de uitlezing met de data-acquisitiekaart. Voer vervolgens opnieuw het data-acquisitieprogramma uit samen met de microscoopscanconsole.

Sla het bestand op en verwerkt de gegevens om een afbeelding te krijgen zoals hier wordt weergegeven. Introduceer een stapel filters tussen de 40x doelstelling en de fotodiode om de pomppulsen te verwijderen en alleen het stokesignaal te verkrijgen. Stel vervolgens het pompsignaal in op 810 nanometer met een geconcentreerd vermogen van acht milliwatt.

Stel het sondesignaal in op 1076 nanometer met dezelfde gerichte kracht van acht milliwatt om een typische Koolstof-Waterstof binding van polystyreen te onderzoeken met een Raman-verschuiving van 3054 omgekeerde centimeters. Sluit de detector aan met de lock-in versterker en de uitlezing van de lock-in versterker op de data-acquisitiekaart. Ten slotte stelt u het pixelformaat en de aanschaftijd in het microscoopprogramma in en voer deze uit en het systeem voor gegevensverwerving, waarbij het matrixbestand wordt opgeslagen zodra het is voltooid.

Een voorbeeldmeting vanaf één punt van het monster wordt hier weergegeven. Wanneer de bundel niet overlapt in tijd of ruimte, is het verkregen resultaat off resonance, waarbij de amplitude van het signaal, gemeten door een lock-in versterker, nul is. De fase van dit signaal, echter, springt tussen negatieve en positieve waarden.

Als de balken in de ruimte overlappen, neemt het signaal toe en bereikt het het maximum wanneer de balken perfect overlappen in de tijd, terwijl de fase begint te bereiken een vaste waarde tijdens de tijd waarin de balken worden overlapt. In een transmissiebeeld wordt een enkele straal gebruikt en wordt de overgebrachte straalintensiteit van het monster gemeten door een fotodiode. Aan de linkerkant werd het transmissiebeeld verkregen met behulp van OPO, terwijl aan de rechterkant het transmissiebeeld werd verkregen met behulp van Titanium-saffier.

Een typisch voorbeeld van een SRS-afbeelding wordt hier getoond, waarin labelvrije afbeeldingen van polystyreenkralen met diameters van drie micrometer worden gerapporteerd. Om een beeld van hoge kwaliteit te verkrijgen, gebaseerd op SRS-microscopie, is de uitlijning van een microscoop van cruciaal belang. Daarom moeten alle aangegeven stappen in het protocol zorgvuldig worden uitgevoerd.