Ruimtelijke en temporele controle van muizen melanoom initiatie van mutant melanocyt stamcellen

Melanoom wordt wereldwijd op grote schaal gediagnosticeerd, met toenemende incidentie. Deze protocollen maken het mogelijk de vroege stadia van melanoom initiatie zorgvuldig worden gecontroleerd, het vergemakkelijken van de studie van de ontwikkeling ervan. Door de tijd en locatie van melanocyten stamcelactivering te controleren, hebben we de mogelijkheid om de veranderingen binnen de stamcelpopulatie en de nieuwe stammelanoominitiatie te onderscheiden.

Het aantonen van de procedure zal Dahihm Kim en Luye An, afgestudeerde studenten van het laboratorium. Twee tot drie dagen voor het begin van de procedure, gebruik maken van een elektrische trimmer om de rughuid scheren van elke verdoofde zeven weken oude muis. Gebruik op de dag van het experiment een wattenstaafje om een dun laagje ontharingscrème op de blootgestelde huid aan te brengen.

Zodra de crème gelijkmatig is aangebracht, gebruik maken van schone wattenstaafjes om de crème te verwijderen, gevolgd door zachte afvegen met een vochtige doek om eventuele resterende crème te verwijderen. Dan terug elke muis naar zijn huis kooi met controle tot volledig herstel. Bedek voor UV-B bestraling de rughuid met UV-B-beschermend materiaal, zodat alleen het gewenste gebied wordt blootgesteld en bedek de UV-kamer met een UV-bestendig deksel.

Zet vervolgens de UV-B-lamp aan om de muis gedurende de juiste experimentele periode te bestralen voordat u de muis terugzet naar een lege kooi met controle tot volledig herstel. Om de huidmonsters te isoleren, gebruik een elektrische trimmer om elk haar te verwijderen uit het dorsale huidgebied van de geëuthanaseerde bestraalde muizen en de blootgestelde huid licht te borstelen met een pluisvrij weefsel om het gebied te verwijderen. Maak een kleine incisie met een scherpe schaar net boven de basis van de staart en steek grote, stompe schaar in de incisie om de onderhuidse bindweefsels te scheiden.

Met behulp van een scherpe schaar, zorgvuldig gesneden langs de rand van het huidgebied van belang om het weefsel monster te isoleren en plaats het uitgesneden huidweefsel op een schone papieren handdoek. Gebruik dan doffe tangen om de huid te strekken, zodat het hecht aan de handdoek en is strak. Wanneer alle monsters zijn geoogst, plaats een huidmonster en papieren handdoek backing in een stuk gevouwen filter papier direct naast de vouw, oppassen dat het monster glad is en niet gevouwen of verfrommeld.

Sluit de zijkanten van het filterpapier met nietjes en snijd het papier bij. Dompelen de monsters vervolgens gedurende drie tot vijf uur bij kamertemperatuur volledig onder in 10% neutraal gebufferd formaline voordat ze de weefsels met twee wasbeurten van vijf minuten in gedeïmiseerd water waste. Verwijder na de tweede wasbeurt zorgvuldig het resterende materiaal uit de huidweefsels en snijd de randen van de monsters zo dat ze niet gekarteld zijn.

Maak vervolgens drie sagittale sneden in elk monster, zodat de breedte van de strips niet meer dan vijf millimeter is, en maak transversale sneden, zodat de monsters niet meer dan 20 millimeter breed zijn. Plaats een cryo-mal met een optimale snijtemperatuur of OCT-medium in een staande oriëntatie en plaats vier tot vijf stukken huid bovenop de OKT. Wanneer alle stukken op hun plaats zijn, gebruik maken van twee paar fijne tangen om de lange rand van elk stuk van de huid te brengen naar de bodem van de cryo schimmel, zodat de monsters zijn verticaal binnen de OCT en loodrecht op de basis van de mal.

Vul vervolgens de mal met extra OCT naar de tweede lip en plaats de mal op een vlakke ondergrond van een stuk droog ijs, met behulp van tangen om eventuele huidstukken die kunnen zijn verschoven tijdens de overdracht aan te passen als het blok begint te bevriezen als dat nodig is. Wanneer muizen zeven weken na de natale zijn, is hun rughuid in telogen. Tijdens de tiener, haarfollikel en melanocyten stamcellen zijn bekend dat in een rustige rusttoestand, en de huid mag geen significante haargroei vertonen na het scheren.

Chemische ontharing, echter, kan leiden tot haarzakje stamcel activering, het induceren van aanzienlijke haargroei binnen de regio van belang. Aangezien chemische ontharing de activering van zowel haarfollikel- als melanocytenstamcellen aanzienlijk kan veroorzaken, kunnen melanoomgevoelige melanocytenstamcellen in een actieve toestand tumoren vormen en kan microscopisch melanoom initiatie binnen twee weken na chemische ontharing worden waargenomen. UV-B bestraling kan ook tumor initiatie veroorzaken van rustige, tumor-gevoelige melanocyten stamcellen.

Belangrijk is dat UV-B de directe translocatie van melanocytenstamcellen van hun folliculaire stamcelnis naar de interfoliculaire opperhuid induceert. Bovendien kan UV-B melanocytenstamcel-oorsprong cutane melanoomvorming gedurende de interfolliculaire opperhuid veroorzaken. Net als bij de huid van de rug, UV-B-geïnduceerde melanoom initiatie kan met name worden waargenomen in andere huidgebieden, zoals de oorhuid.

Sterker nog, in vergelijking met de controle oor huid, bedekt met UV-resistente doek, oor huid blootgesteld aan UV-B toont een hogere pigmentatie als gevolg van een hogere last van melanoom initiatie. Verschillende doses UV-B kunnen verschillende effecten hebben op de huid van de muis en de activiteit van melanocyten. Daarom is het belangrijk om de bestralingsdosis te bepalen en te optimaliseren voordat u met uw experiment begint.