Analyse van interacties tussen Endobiotica en humane gut microbiota met behulp van in-vitro Bad fermentatiesystemen
23 augustus 2019
Hier beschreven is een protocol om de interacties tussen endobiotica en menselijke gut microbiota met behulp van in vitro batch fermentatiesystemen te onderzoeken.
Ons protocol kan op grote schaal worden gebruikt voor hoge doorvoer en snelle screening van de interacties tussen endobiotica en menselijke darmmicrobiota. Lage kosten en het vermijden van interferentie-effecten van het metabolisme van de gastheer. Deze procedure heeft het potentieel om te worden gebruikt bij de diagnose.
Los eerst BIF EPS en zetmeel individueel op in heet water op een magnetische agitator om zowel de concentratie van acht gram per liter te maken. Voeg in het geprepareerde basiscultuurmedium VI 100 milliliter van de BIF EPS-oplossing toe om cultuur VI BIF-oplossing te maken. Voeg 100 milliliter van de zetmeeloplossing toe om cultuur VI zetmeeloplossing te maken.
Autoclave de twee media met koolstofbron, en het medium zonder koolstofbron als een controle, op 121 graden Celsius gedurende 15 minuten. Laat ze afkoelen tot kamertemperatuur en voeg hooimannen en cysteïne toe. Breng een submonster van vijf milliliter van elk medium naar kweekbuizen over.
En bewaar in een anaerobe couveuse. Bewaar de resterende media op vier graden Celsius. Om menselijk fecal monster voor te bereiden, breng je een gram vers fecale monster over in 10 milliliter anaërobe PBS bij pH zeven in een glazen bekerglas.
Gebruik dan een glazen staaf om het te roeren om een drijfmest te bereiken. Voeg in een anaerobe kamer 500 microliter van de gefilterde fecale drijfmest individueel toe aan de drie bereide fermentatiemedia. Dan, incubeer bij 37 graden Celsius.
Verzamel na 24 uur en 48 uur twee milliliter gefermenteerde monsters in de anaerobe kamer. En dan buiten de kamer centrifugeren op 6000 keer G, gedurende drie minuten. Breng de supernatants voorzichtig over op nieuwe centrifugebuizen die worden gebruikt voor polysaccharidedegradatieanalyse en korte-keten vetzuurmetingen.
Bewaar de centrifugatiepellets op 80 graden Celsius. Laad 0,2 microliter van de gefermenteerde supernatants op elke voorgecoate silica gel 60 TLC aluminium plaat en wervel om te verspreiden. Gebruik dan een föhn met hete lucht te drogen.
Dompel het ene uiteinde van de bemonsterde platen onder in 20 milliliter mierenzuur:n-butanol:wateroplossing gedurende enkele minuten, totdat de elektroforese zich bijna tot het andere uiteinde uitstrekt. Neem vervolgens de platen met tangen, en droog met een föhn. Vervolgens weken de platen in de orcinol reagens voor twee minuten te verven.
En droog weer. Breng de platen op 120 graden Celsius naar een bakoven om drie minuten te verwarmen. Neem vervolgens foto's van de plaat om de afbraak van EPS te evalueren door TLC-banden te meten.
Om de effecten van EPS op de productie van SCFA te bestuderen, voeg een milliliter van de gefermenteerde supernatants toe aan twee milliliter centrifugebuizen en voeg 0,2 milliliter van 25 gewicht/volumecentidruk aan elk monster toe. Vortex om de oplossingen grondig te mengen. Centrifugeren de mengsels op 13.000 keer G gedurende 20 minuten.
In de tussentijd, oplossingen voor te bereiden van 120 millimolar azijn, propionische, butyrische, isobutyrische, valeriische en isovalerische zuren in buizen. Voeg vervolgens een milliliter van elk bereid zuur toe aan een buis met 1,2 milliliter 25 gewicht/volumecenter metaphosportzuur. En laad ze in de monsterfles van het gaschromatografie-instrument als de standaard cocktails.
Haal de buizen uit de centrifuge en breng de supernatants over op verse buizen. Gebruik een spuit uitgerust met 0,22 micron filter om de supernatants te filteren in nieuwe buizen voor gaschromatografie analyse. In deze studie werd de productie van mucoid EPS waargenomen in bifidobacterium longum culturen op PYG-platen, na anaerobe incubatie gedurende 72 uur.
Centrifugatie van cultuurschaafwonden, gevolgd door ethanolneerslag en drogen, resulteerde in de inzameling van cellulose-achtige EPS. Uit TLC-analyse bleek dat de afbraaksnelheid van zetmeel door menselijke fecale microbiota sneller was dan die van BIF EPS. Principal Coordinate Analysis toont cultuur VI BIF, en cultuur VI zetmeel groepen, afzonderlijk van elkaar geclusterd, wat aangeeft dat EPS en zetmeel beschikbaarheid differentieel vorm menselijke fecale bacteriële gemeenschappen.
Lineaire discriminant Analyse op effectgrootte toont de genera collinsella, coprococcus, parabacteroides, en rhodopseudomonas waren aanzienlijk overvloediger in de cultuur VI BIF monsters dan in de cultuur VI zetmeel monsters. Bovendien, GC metingen tonen SCFAs die werden gemeten aan de hand van fermentatie culturen opgenomen azijn, propionische, isobutyrische, butyrische, isovalerische, en valeriaanzuren. Na gisting gedurende 24 uur en 48 uur, vijf van de zes SCFA concentraties waren vergelijkbaar en niet statistisch verschillend tussen de cultuur VI BIF, cultuur VI zetmeel, en cultuur VI groepen.
Echter, propriche zuurconcentraties waren aanzienlijk hoger in de cultuur VI BIF groep dan in de cultuur VI zetmeel groep, na 48 uur van fermentatie. Doe dit experiment onder anaërobe omstandigheden en breng de vaste monsters zo snel mogelijk over in een anaerobe incubator. Sommige TLC-reagentia zijn gevaarlijk.
Je moet voorzichtig zijn om ze te gebruiken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol onderzoekt de interacties tussen endobiotica en de menselijke darmmicrobiota met behulp van in vitro batch-fermentatiesystemen. Het is ontworpen voor high-throughput en snelle screening, waardoor interferentie door het metabolisme van de gastheer wordt geminimaliseerd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Microbiologie
- Darmgezondheid
- Metabolomics
Achtergrond
- Endobiotica spelen een cruciale rol in de menselijke gezondheid.
- De darmmicrobiota beïnvloedt metabole processen aanzienlijk.
- Inzicht in deze interacties kan helpen bij de diagnostiek.
- Huidige methoden kunnen beperkt worden door interferentie van het metabolisme van de gastheer.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor het bestuderen van interacties tussen endobionten en het microbioom.
- Het mogelijk maken van high-throughput screening van deze interacties.
- Het bieden van een kosteneffectief alternatief voor onderzoek.
Gebruikte methoden
- Oplossen van BIF EPS en zetmeel in heet water.
- Bereiden van cultuurmedia voor fermentatie.
- Gebruik van batch-fermentatiesystemen voor interactiestudies.
- Monitoren van de effecten van endobiotica op de darmmicrobiota.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle bereiding van BIF EPS- en zetmeeloplossingen.
- Vaststelling van een betrouwbaar fermentatieprotocol.
- Demonstratie van het potentieel van het protocol voor diagnostiek.
- Inzichten in de interacties tussen endobiotica en microbiota.
Conclusies
- Het protocol biedt een waardevol instrument voor microbiota-onderzoek.
- Het kan het begrip van metabole interacties vergemakkelijken.
- Toekomstige toepassingen kunnen de diagnostische mogelijkheden verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Dit protocol maakt high-throughput, kosteneffectieve in vitro screening van interacties tussen endobiotica en het darmmicrobioom mogelijk, waardoor de afhankelijkheid van diermodellen wordt verminderd en interferentie door het metabolisme van de gastheer wordt geminimaliseerd. Het ondersteunt validatie van targets in een vroeg stadium door kwantitatieve gegevens te leveren over verschuivingen in de microbiële gemeenschap en de productie van metabolieten, wat essentieel is voor het verminderen van risico's bij therapeutica die het microbioom moduleren. Deze benadering is direct toepasbaar op preklinische discovery-workflows, waarbij mechanistisch inzicht in de effecten van verbindingen op het microbioom de selectie van lead-verbindingen en portfoliobeslissingen ondersteunt.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om te onderzoeken hoe endobiotica, zoals prebiotica of geneesmiddelen, bacteriële gemeenschappen in de menselijke darm moduleren, wat het testen van doelgerichte hypothesen ondersteunt.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van toegankelijke methoden, zoals 16S rRNA-sequencing en SCFA-kwantificering, om reproduceerbare en mechanistisch informatieve gegevens te genereren.
- Voorspellende waarde: Maakt onderscheid tussen microbiële responsen op structureel verschillende koolhydraten (bijv. EPS versus zetmeel), wat helpt bij beoordelingen van de structuur-activiteitsrelatie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt gestandaardiseerde anaerobe fermentatiecondities voor een consistente evaluatie van door microbiota gemedieerde afbraak van verbindingen.
- Operationele waarde: Compatibel met high-throughput formats dankzij eenvoudige monsterpreparatie en schaalbare read-outs zoals TLC en GC.
- Klaarheid voor assay: Genereert kwantificeerbare output (SCFA-profielen, verschuivingen in de community) die kunnen worden gebruikt om effecten van verbindingen over verschillende screeningscampagnes heen te vergelijken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Maakt gebruik van menselijk fecaal inoculum, wat de relevantie voor de menselijke fysiologie vergroot in vergelijking met diermodellen.
- Mechanistische risicoreductie: Identificeert specifieke microbiële responders (bijv. Collinsella, Coprococcus) op endobiotica, wat een op biomarkers gebaseerd werkingsmechanisme ondersteunt.
- Preklinische continuïteit: Maakt dosis- en tijdsafhankelijke profilering (24u/48u) mogelijk om informatie te verschaffen over veiligheids- en effectiviteitsvensters in latere modellen.
Integratie van pijplijn en workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadoptimalisatie, in het bijzonder voor microbiome-actieve verbindingen waarbij inzicht in het door microbiota gemedieerde metabolisme essentieel is voor het voorspellen van het in vivo gedrag.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesegedreven screening van endobiotica door blootstelling aan verbindingen te koppelen aan meetbare veranderingen in microbiële compositie en functie.
- Screening: Maakt snelle beoordeling van microbiota-interacties mogelijk met TLC voor polysacharide-degradatie en GC voor SCFA-kwantificering als orthogonale read-outs.
- Analytica: Genereert multivariate gegevens (16S-sequencing, SCFA-concentraties) die statistische vergelijking van behandelingseffecten en identificatie van significante verschuivingen mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Maakt gebruik van microbiota van menselijke oorsprong, wat het voorspellend vertrouwen voor klinische vertaling verbetert ten opzichte van muismodellen.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Het protocol is aanpasbaar aan diverse endobiotica (geneesmiddelen, prebiotica, polysachariden), waardoor het een herbruikbaar platform is over verschillende therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in microbiota-endobiotische interacties door directe observatie van degradatiepatronen en microbiële responsen.
- Operationele waarde: Lage kosten, een anaerge workflow en gestandaardiseerde bemonstering verbeteren de reproduceerbaarheid en de vergelijkbaarheid tussen laboratoria.
- Strategische waarde: Maakt eerdere go/no-go-beslissingen mogelijk door microbiota-gemedieerd metabolisme te signaleren dat de effectiviteit of toxiciteit van geneesmiddelen kan beïnvloeden.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen op basis van hun impact op gunstige microbiota en SCFA-profielen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in anaerobe microbiologie en steriele techniek om de integriteit van de monsters te waarborgen.
- Toegang tot TLC-platen, gaschromatografie en 16S rRNA sequencing-infrastructuur is noodzakelijk voor het volledige analysepanel.
- Standaardisatie tussen laboratoria vereist consistente verwerking van fecale donoren en uniforme anaerobe incubatiecondities.
- Aanpassing aan andere endobiotica vereist oplosbaarheid- en stabiliteitstesten onder fermentatiecondities.
- Praktische beperkingen omvatten variabiliteit in het microbiota van de donor en de noodzaak voor zorgvuldige omgang met gevaarlijke TLC-reagentia (bijv. orcinol, mierenzuur).
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Preparation of Fermentation Medium and Human Fecal Sample
1:48
In Vitro Batch Fermentation
2:33
EPS Degradation by Human Fecal Microbiota
3:29
Effects of EPS on SCFA (Short-chain Fatty Acids) Production by Human Intestinal Microbiota
4:41
Results: Degradation by Fermentation
6:24
Conclusion
