Analyse van interacties tussen Endobiotica en humane gut microbiota met behulp van in-vitro Bad fermentatiesystemen

Ons protocol kan op grote schaal worden gebruikt voor hoge doorvoer en snelle screening van de interacties tussen endobiotica en menselijke darmmicrobiota. Lage kosten en het vermijden van interferentie-effecten van het metabolisme van de gastheer. Deze procedure heeft het potentieel om te worden gebruikt bij de diagnose.

Los eerst BIF EPS en zetmeel individueel op in heet water op een magnetische agitator om zowel de concentratie van acht gram per liter te maken. Voeg in het geprepareerde basiscultuurmedium VI 100 milliliter van de BIF EPS-oplossing toe om cultuur VI BIF-oplossing te maken. Voeg 100 milliliter van de zetmeeloplossing toe om cultuur VI zetmeeloplossing te maken.

Autoclave de twee media met koolstofbron, en het medium zonder koolstofbron als een controle, op 121 graden Celsius gedurende 15 minuten. Laat ze afkoelen tot kamertemperatuur en voeg hooimannen en cysteïne toe. Breng een submonster van vijf milliliter van elk medium naar kweekbuizen over.

En bewaar in een anaerobe couveuse. Bewaar de resterende media op vier graden Celsius. Om menselijk fecal monster voor te bereiden, breng je een gram vers fecale monster over in 10 milliliter anaërobe PBS bij pH zeven in een glazen bekerglas.

Gebruik dan een glazen staaf om het te roeren om een drijfmest te bereiken. Voeg in een anaerobe kamer 500 microliter van de gefilterde fecale drijfmest individueel toe aan de drie bereide fermentatiemedia. Dan, incubeer bij 37 graden Celsius.

Verzamel na 24 uur en 48 uur twee milliliter gefermenteerde monsters in de anaerobe kamer. En dan buiten de kamer centrifugeren op 6000 keer G, gedurende drie minuten. Breng de supernatants voorzichtig over op nieuwe centrifugebuizen die worden gebruikt voor polysaccharidedegradatieanalyse en korte-keten vetzuurmetingen.

Bewaar de centrifugatiepellets op 80 graden Celsius. Laad 0,2 microliter van de gefermenteerde supernatants op elke voorgecoate silica gel 60 TLC aluminium plaat en wervel om te verspreiden. Gebruik dan een föhn met hete lucht te drogen.

Dompel het ene uiteinde van de bemonsterde platen onder in 20 milliliter mierenzuur:n-butanol:wateroplossing gedurende enkele minuten, totdat de elektroforese zich bijna tot het andere uiteinde uitstrekt. Neem vervolgens de platen met tangen, en droog met een föhn. Vervolgens weken de platen in de orcinol reagens voor twee minuten te verven.

En droog weer. Breng de platen op 120 graden Celsius naar een bakoven om drie minuten te verwarmen. Neem vervolgens foto's van de plaat om de afbraak van EPS te evalueren door TLC-banden te meten.

Om de effecten van EPS op de productie van SCFA te bestuderen, voeg een milliliter van de gefermenteerde supernatants toe aan twee milliliter centrifugebuizen en voeg 0,2 milliliter van 25 gewicht/volumecentidruk aan elk monster toe. Vortex om de oplossingen grondig te mengen. Centrifugeren de mengsels op 13.000 keer G gedurende 20 minuten.

In de tussentijd, oplossingen voor te bereiden van 120 millimolar azijn, propionische, butyrische, isobutyrische, valeriische en isovalerische zuren in buizen. Voeg vervolgens een milliliter van elk bereid zuur toe aan een buis met 1,2 milliliter 25 gewicht/volumecenter metaphosportzuur. En laad ze in de monsterfles van het gaschromatografie-instrument als de standaard cocktails.

Haal de buizen uit de centrifuge en breng de supernatants over op verse buizen. Gebruik een spuit uitgerust met 0,22 micron filter om de supernatants te filteren in nieuwe buizen voor gaschromatografie analyse. In deze studie werd de productie van mucoid EPS waargenomen in bifidobacterium longum culturen op PYG-platen, na anaerobe incubatie gedurende 72 uur.

Centrifugatie van cultuurschaafwonden, gevolgd door ethanolneerslag en drogen, resulteerde in de inzameling van cellulose-achtige EPS. Uit TLC-analyse bleek dat de afbraaksnelheid van zetmeel door menselijke fecale microbiota sneller was dan die van BIF EPS. Principal Coordinate Analysis toont cultuur VI BIF, en cultuur VI zetmeel groepen, afzonderlijk van elkaar geclusterd, wat aangeeft dat EPS en zetmeel beschikbaarheid differentieel vorm menselijke fecale bacteriële gemeenschappen.

Lineaire discriminant Analyse op effectgrootte toont de genera collinsella, coprococcus, parabacteroides, en rhodopseudomonas waren aanzienlijk overvloediger in de cultuur VI BIF monsters dan in de cultuur VI zetmeel monsters. Bovendien, GC metingen tonen SCFAs die werden gemeten aan de hand van fermentatie culturen opgenomen azijn, propionische, isobutyrische, butyrische, isovalerische, en valeriaanzuren. Na gisting gedurende 24 uur en 48 uur, vijf van de zes SCFA concentraties waren vergelijkbaar en niet statistisch verschillend tussen de cultuur VI BIF, cultuur VI zetmeel, en cultuur VI groepen.

Echter, propriche zuurconcentraties waren aanzienlijk hoger in de cultuur VI BIF groep dan in de cultuur VI zetmeel groep, na 48 uur van fermentatie. Doe dit experiment onder anaërobe omstandigheden en breng de vaste monsters zo snel mogelijk over in een anaerobe incubator. Sommige TLC-reagentia zijn gevaarlijk.

Je moet voorzichtig zijn om ze te gebruiken.