Een statische zelfsturende methode voor het genereren van hersenorganoïden uit menselijke embryonale stamcellen

Menselijke hersenorganoïden zijn een belangrijk hulpmiddel om ziekten te bestuderen in een systeem dat gemakkelijk kan worden gemanipuleerd en een menselijke omgeving en de juiste interactie van meerdere celtypen bevat. Deze techniek kan worden toegepast op tal van ziekten van de hersenen te bestuderen, met inbegrip van neurodevelopmental aandoeningen, toxische beledigingen, en de groei en behandeling van kanker in de hersenen. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is de mogelijkheid om zeer reproduceerbare hersenorganoïden te genereren met een breed scala aan neuronale celtypen.

Dit wordt gedaan met behulp van een zeer simplistische workflow die kan worden bereikt door de meeste laboratoria. En deze worden geproduceerd op een tijdelijke passende manier zonder de invloed van gespecialiseerde groeifactoren of ongedefinieerde matrices waardoor het een zeer eenvoudig en kosteneffectief systeem. Om te beginnen, combineren 100 microliter matrix met 5,9 milliliter van ijskoude Dulbecco's Modified Eagle Medium of F12 media in een 15 milliliter conische buis.

Coat elk goed in een zes-put plaat met een milliliter van het membraan matrix. Wikkel de plaat in paraffinefilm en bewaar 's nachts op vier graden Celsius. De volgende dag, aspirate overtollige media van elke put, spoel de putten met F12, en voeg H9 hESCS in een totaal volume van twee milliliter van mTeSR1 media per goed.

Cultuur de cellen van week tot week. Lever dagelijks twee milliliter mTeSR1-media en plaats de plaat in een 37 graden Celsius lage zuurstof incubator met 5% zuurstof en 5% kooldioxide. Gebruik glasgereedschappen om cellen te onderscheiden van de cultuur tussen passages.

Vernieuw de media dagelijks. Cellen moeten vier tot zes dagen voorafgaand aan het gebruik van de H9-cellen voor organoïde productie worden doorgegangerd. Om de cellen door te geven, begin met het spoelen van ze met DMEM F12-media en het aspireren van de overtollige vloeistof.

Voeg na het spoelen protease-oplossing toe en vouw de cellen gedurende 40 minuten uit om kolonies in de put te laten zweven. Vervolgens was de cellen drie keer met behulp van DMEM F12 en indien nodig titreer om de stukken kleiner te maken. Verdeel vervolgens de cellen bij een verhouding van ongeveer één tot acht over vier zes-putplaten en plaats de platen in de couveuse en voer dagelijks.

Na vier tot zes dagen bereiken de cellen ongeveer 80%-samenvloeiing. Schakel ze over naar een gewone couveuse. Verdun de protease stock oplossing tot een werkconcentratie door het toevoegen van een milliliter van de voorraad oplossing tot vijf milliliter DMEM of F12 medium per elke zes-well plaat van hESCS.

Aspirate en verwijder de cel cultuur media, dan dekt de hESCS met de protease oplossing. Plaats de platen in de couveuse gedurende 10 tot 15 minuten of totdat de randen van de kolonies naar boven afronden en beginnen te scheiden van de matrix, maar voordat ze volledig afronden. Kantel de plaat, aspirate de protease oplossing, en voorzichtig wassen van de cellen met twee milliliter DMEM of F12 voor elke put drie keer.

Zorg ervoor dat de kolonies aan de matrix gehecht blijven. Het is dus van cruciaal belang dat de stukken ES-cellen in de juiste grootte zijn, dus zorg ervoor dat ze in dispase zijn voor de juiste hoeveelheid tijd. Als ze daar te kort van een tijd, kan het heel moeilijk zijn om ze af te spoelen en uit elkaar te breken.

En als ze daar te lang zijn, kunnen ze er gewoon afkomen tijdens de wasstappen. Voeg terug ongeveer een tot 1,5 milliliter verse mTeSR media aan elke put en spoel de cellen uit de plaat in een 50 milliliter conische buis met behulp van zachte pipetting. Aspirate en afzien van hESCS in de plaat totdat ze ongeveer 1/30e van hun oorspronkelijke grootte bereiken.

Nu lijken de kolonieclusters op stukken van 250 tot 350 micrometer. Breng de cellen in een enkele ultra lage bevestiging T75 kolf met 30 milliliter mTeSR media zonder bFGF. De volgende dag, kantel de kolf zodanig dat de levende cellen zwembad in de hoek.

Als er een groot aantal cellen zijn die zich aan de bodem van de kolf hebben vastgehangen, gebruik dan een pipet van 10 milliliter om de cellen naar een nieuwe kolf over te brengen. Verwacht een hoge populatie van dode cellen voor de eerste paar dagen. Zodra de cellen vestigen, aspirate uit de media en dode cellen waardoor ongeveer 10 milliliter van de media met de levende cellen en voeg 20 milliliter van lage bFGF media aangevuld met 30 nanogram per milliliter van bFGF.

Controleer na twee dagen de cellen. De meeste cellen moeten er gezond en helder uitzien. Echter, als meer dan een derde van de cellen lijkt donker, kantelen de kolf en vervang 20 milliliter van de media met 20 milliliter lage bFGF media aangevuld met 20 nanogram per milliliter van bFGF.

Op dag drie, verwijder de helft van de media en vervangen door 15 milliliter hESC media aangevuld met 10 nanogram per milliliter van bFGF. Op dag vijf, vervang de helft van de media met 15 milliliter neurale inductiemedia. Daarna, om de andere dag, vervang de helft van het medium door neurale inductiemedia.

Na drie weken in cultuur, voeg 100X Penicilline-Streptomycine aan de media bij een definitieve concentratie van 1X indien gewenst. Vernieuw de helft van de media om de andere dag. In dit protocol zagen de gevormde hersenorganoïden er helder en vergelijkbaar uit in grootte zonder donkere stervende cellen in de centra van deze clusters.

De cellen werden geleidelijk gespeend uit bFGF. Op dag vijf werden ze in neurale inductiemedia geplaatst en bleven ze gedurende de hele cultuurperiode in deze media. Hoewel de organoïden na verloop van tijd groter en dus donkerder werden, breidden de neurale rozetachtige structuren zich uit die de initiatie van neurale differentiatie aangeeft en kenmerken van de embryonale neurale buis bevatten.

Om de genexpressie in de cellen nader te bekijken, werd een qPCR-analyse uitgevoerd. De glutamaat transporter VLGUT1 werd uitgedrukt op twee en een halve week, verhoogd op vijf weken, en bleef consistent door middel van vijf maanden van cultuur. Een voorhersenen marker Foxg1 werd uitgedrukt op lage niveaus tot vijf weken in de cultuur.

De diepe laag marker Tbr1 piekte ongeveer vijf weken en daalde vervolgens. Terwijl de expressie van de bovenste laag marker Satb2, de ventrale marker Eng1, de hindbrain ruggenmerg marker Hoxb4, evenals de oligodendrocyte marker Olig2 alle toegenomen na verloop van tijd. De stamcelmarker Sox2 is daarentegen in de loop van de tijd afgenomen.

De glial marker GFAP piekte op vijf weken en bleef daarna relatief constant. Vergeet niet om de grootst mogelijke zorg te nemen bij het hanteren van ES-cellen in een vroeg stadium organoïden om besmetting te voorkomen als ze worden geteeld zonder antibiotica en ook niet vergeten om te voeden volgens schema. Na deze procedure u de organoïden evalueren met behulp van technieken zoals kwantitatieve RT-PCR voor genexpressie en immunofluorescentie voor eiwitexpressie en lokalisatie.

Met behulp van deze techniek konden we het vermogen van een klein molecuul bestuderen om aspecten van menselijke neonatale hypoxische verwondingen te verlichten, zoals gemodelleerd in een hypoxiekamer. Het is veelzeggend dat deze menselijke hersenen organoïden gedroegen zich op dezelfde manier als in vivo muis experimenten.