Universeel en efficiënt elektroporatieprotocol voor genetische manipulatie van gastro-intestinale organoïden

Deze methode maakt een efficiënte transfectie van 3D-celculturen zoals organoïden mogelijk. Verschillende toepassingen van genetische manipulatie kunnen worden vergemakkelijkt. Het protocol is universeel en kan binnen één dag worden uitgevoerd.

Het heeft geen uitgebreide voorbereiding of speciale, kostenintensieve elektroporatiebuffers nodig. Deze transfectie methode werd aangetoond in tumor en gezonde organoïden, maar het kan worden aangepast aan sferoïden en 2D-celcultuur, ook. Als het uitvoeren van dit protocol voor de eerste keer, is het belangrijk om de organoïden te behandelen met zorg vanwege hun individuele proliferatie en reactie op dissociatie.

Controleer ze microscopisch tijdens de hele procedure. Begin met het voorverwarmen van 48-well platen op 37 graden Celsius voor post elektroporatie zaaien, bereid dan basale en organoïde cultuur-specifieke mediums volgens manuscript richtingen. Cultiveren vijf putten van organoïden per elektroporatie monster in een 48-well plaat, bereiden 230 microliter van dissociatie reagens met 10-micromolar Y-27632 per put.

Controleer de organoïden onder een microscoop. Verwijder het kweekmedium uit de putten en distantieer de organoïden mechanisch in het voorbereide dissociatiemengsel. Pool vijf putten per elektroporatie monster in een 15-milliliter buis.

Meng de inhoud van de buis door vortexing en uitbroed het gedurende vijf tot 15 minuten op 37 graden Celsius tot clusters van 10 tot 15 cellen optreden, het controleren van de dissociatie met een microscoop. Stop de spijsvertering door het toevoegen van maximaal 10 milliliter basale medium zonder antibiotica. Centrifugeer de buis op 450 keer g gedurende vijf minuten, gooi de supernatant, en was de cellen twee keer met vier milliliter elektroporatie buffer.

Centrifuge en gooi de supernatant na elke wasbeurt. Na de wasbeurten, resuspend de organoïde pellet in 100 microliter van elektroporatie buffer met 30 microgram plasmide DNA. Doe het volledige DNA-organoïde mengsel in een elektroporatie cuvette.

Zorg ervoor dat u luchtbellen vermijdt. Stel de elektroporatieparameters in zoals beschreven in het tekstmanuscript en tik met een vinger op de cuvette om de cellen voorzichtig te mengen. Plaats de cuvette in de cuvettekamer en druk op de impedantieknop op de elektroporator om een notitie te maken van de impedantiewaarde.

Druk op de startknop om het elektroporatieprogramma te starten en de waarden van de weergegeven stromen, spanningen en energieën te regelen. Voeg na elektroporatie onmiddellijk 500 microliters cultuurmedium zonder antibiotica toe aan de cellen en meng door op en neer te pipetten. Breng het monster in een nieuwe buis van 15 milliliter en spoel de cuvette met basaal medium om de resterende cellen te verzamelen en vervolgens de cellen 40 minuten bij kamertemperatuur uit te broeden.

Centrifugeren de cellen op 450 keer g gedurende vijf minuten en gooi de supernatant. Resuspend de pellet in 100 microliters van kelder matrix en zaad 20-microliter druppels in een voorverwarmde 48-put plaat. Incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius voor polymerisatie en voeg 250 microliters van cultuurmedium toe aangevuld met Y-27632 en CHIR99021 per put.

Om de transfectie-efficiëntie te bepalen, controleert u de fluorescentie in de transfectiecontrole onder de microscoop na 24 tot 48 uur. Voor FACS-analyse, oogst de cellen zoals eerder beschreven en verteren gedurende 10 tot 20 minuten tot er enkele cellen aanwezig zijn. Voeg maximaal 10 milliliter PBS toe en centrifugeer de cellen op 450 keer g gedurende vijf minuten, dan aanzuigen en gooi de supernatant.

Om te discrimineren voor levende cellen, resuspend de pellet in een milliliter PBS en voeg een geschikt antilichaam of propidium jodide. Meng de cellen voorzichtig door ze 30 minuten in het donker op kamertemperatuur te tikken en uit te broeden. Na de incubatie was je de cellen met 10 milliliter PBS, verstek en gooi je de supernatant weg.

Resuspend de celpellet in 200 microliters van PBS en filter de suspensie door een 100-micrometer zeef in een FACS buis. Analyseer de cellen met een FACS-machine met behulp van de juiste gatingstrategie en bepaal de transfectie-efficiëntie. Organoïden van vier verschillende kankerentiteiten werden minstens drie keer geëlektrpoleerd met behulp van 30 microgram van een kleine plasmid of grote plasmide.

Ze werden 48 uur na elektroporatie geanalyseerd met stroomcytometrie en werden afgesloten voor celvorm, enkele cellen, levende cellen en eGFP-expressie. In alle vier organoïde entiteiten werd de kleine plasmide doorgetransfecteerd met een hogere efficiëntie dan de grotere. De meest efficiënte transfectie van de kleine plasmide werd bereikt in PDAC-organoïden met 92,1%GFP-positieve cellen, overwegende dat de grote plasmide werd doorgetransfecteerd met een rendement van 46,7%De grotere plasmide werd efficiënter omgezet in CRC-organoïden met een gemiddelde efficiëntie van 53,4%, terwijl de kleine plasmide werd doorgetransfecteerd met een gemiddelde efficiëntie van 84,3%De moeilijkste entiteit om te transfecteren waren maagkankerorganoïden , waaruit bleek dat beide plasmiden de laagste transfectie-efficiëntie vertoonden.

Als bewijs van concept, werden de menselijke normale maagorganoïden geëlektroreerd met een plasmide codering voor Cas9, GFP, en 2sgRNAs die TP53 richten. Klonen werden geselecteerd door Nutlin3 administratie en de TP53 knock-out werd bevestigd door sequencing van de allelen. Zoals we met de menselijke maagorganoïden hebben aangetoond, maakt efficiënte elektroporatie verschillende CRISPR Cas9-basismanipulaties van organoïde culturen mogelijk, zoals knock-out of knockins, zodat verschillende ziekten kunnen worden gemodelleerd.