Een protocol voor meerdere gene-knock-out in muizen, kleine darmorganen, met behulp van een CRISPR-concatemer

Het algemene doel van dit protocol is om meerdere guide-RNA's in één CRISPR-concatemeer-vector te kloneren en om een zeer efficiënte elektroporatie in muis-intestinale organoïden te bereiken, om zo een simultane knockout van meerdere genen te verkrijgen. Deze methode kan de efficiëntie van loss-of-function-studies aanzienlijk verbeteren door het mogelijk te maken het potentiële effect van parallelle compensatie te overwinnen. De belangrijkste voordelen van onze CRISPR-concatemeer-strategie zijn het gemak van een enkele kloneringsstap en de mogelijkheid om een simultane knockout van maximaal vier verschillende genen uit te voeren.

De procedure wordt gedemonstreerd door Alessandra Merenda, een PhD-student uit mijn laboratorium. De klonering van guide RNA's of gRNA's in de CRISPR-concatemeer-vector begint met een enkele reactie om de bovenste en onderste strengen van elk gRNA-oligonucleotide te annexeren en hun uiteinden te fosforyleren. Bereid het reactiemengsel op ijs voor; gebruik voor drie concatemeren drie µL bovenste streng gRNA's, drie µL onderste streng gRNA's, twee µL T4 DNA-ligasebuffer, één µL T4-polynucleotidekinase en water tot een totaal volume van 20 µL.

Meng goed door te pipetteren en start de thermocycler met de volgende instellingen: 37 °C gedurende 30 minuten, 95 °C gedurende vijf minuten, geleidelijk afkoelen naar 25 °C met een snelheid van 0,3 °C per minuut en vasthouden op 4 °C. De volgende stap is de Bbs1-shufflingreactie, waarbij de vooraf geannealde gRNA-oligonucleotiden worden ingebouwd op de juiste positie van de concatemeervector. Verdun het reactiemengsel 1:100 in DNA- en RNA-vrij water om vectoren met drie en vier gRNA-concatemeren te genereren.

Stel de Bbs1-shufflingreacties samen op ijs. Gebruik 100 nanogram CRISPR-concatemeervector, 10 microliter oligomengsel, één microliter restrictie-enzymbuffer, één microliter DTT, één microliter ATP, één microliter Bbs1-enzym, één microliter T7-ligase en water tot een totaalvolume van 20 microliter. Meng goed door te pipetteren en voeg een negatieve controle toe die de vector bevat.

Voer de reacties uit in een thermocycler met de volgende instellingen: voor het kloneren van drie en vier gRNA-concatameren worden 50 cycli uitgevoerd bij 37 degree celsius gedurende vijf minuten en 21 degrees celsius gedurende vijf minuten, gevolgd door een hold op 37 degree celsius voor 15 minuten en vervolgens een hold op four degree celsius onbepaald. Voor twee gRNA-concatameren worden dezelfde instellingen gebruikt, maar met 25 cycli van stap één. Wanneer de Bbs1-shufflingreactie is voltooid, worden 11 microliters van elk ligatiemengsel samengevoegd met 1.5 microliters exonucleasebuffer, 1.5 microliters ATP, one microliter DNA-exonuclease en water tot een totaalvolume van 15 microliters.

Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C, gevolgd door 30 minuten bij 70 °C. Vervolgens wordt het reactiemengsel gebruikt om chemisch competente E. coli-bacteriën te transformeren, volgens een standaardprotocol. Om de aanwezigheid van gRNA-inserten in de CRISPR-concatemeer-vector te bevestigen, worden bacteriekolonies met een entlus opgepikt en in vier milliliter LB-medium geënt.

Kweek de klonen overnacht bij 37 °C in een orbitale schudder. De volgende dag wordt het DNA geëxtraheerd met een plasmid miniprep kit, volgens de instructies van de fabrikant. Meng ongeveer 200 ng van elk DNA-monster met 10 units EcoR1 en vijf units BglII in een reactievolume van 10 µL.

Voeg een apart reactiemengsel met de overeenkomstige oorspronkelijke vector toe als positieve controle voor de vergelijking van de grootte. Incubeer de reacties gedurende drie uur bij 37 °C. Voer de digestiereacties uit op een 1% agarosegel bij 90 volt gedurende ongeveer 20 minuten.

Visualiseer de gel met een UV-transilluminator om de klonen met de juiste insertgrootte te identificeren. Om te bevestigen dat de gRNA's in de juiste positie zijn gekloond en bijgevolg alle Bbs1-herkenningsplaatsen verloren zijn gegaan, digest je de geselecteerde klonen met vijf eenheden Bbs1. Voeg een aparte reactiemix toe met de overeenkomstige oorspronkelijke vector als controle.

Incubeer gedurende drie uur bij 37 °C en voer de digestiereacties uit op een 1% agarosegel bij 90 volt gedurende ongeveer 20 minuten. Visualiseer de gel met een UV-transilluminator om de vectoren te identificeren die niet door Bbs1 zijn geknipt. Zaai bij het splitsen van organoïden voor electroporatie minimaal zes wells van een 48-well plaat per transvectie.

Zaai de organoïden uit in druppels van 20 µL basementmatrix en kweek deze in 250 µL WENR plus nicotinamide medium per well bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator. Vervang op dag twee het WENR plus nicotinamide medium door 250 µL medium met EGF plus noggin, GSK3-remmer en ROCK-remmer zonder antibiotica. Ververs op dag drie het organoïdenmedium naar EGF plus noggin, GSK3-remmer, ROCK-remmer en 1,25% dimethylsulfoxide zonder antibiotica.

Ontricht op dag vier de koepels van de basale matrix met behulp van een pipetpunt van één milliliter en breng de organoïden over naar een buisje van 1,5 milliliter. Trek de inhoud van vier putjes van een 48-wells plaat in één buisje. Breek de organoïden mechanisch in kleine fragmenten door ongeveer 200 keer op en neer te pipetteren met de P200-pipet.

Centrifugeer bij 600 ×g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder na centrifugatie het medium uit alle buizen en resuspendeer de pellets in één milliliter recombinante protease van celkulturkwaliteit. Incubeer bij 37 °C gedurende maximaal vijf minuten.

Het is belangrijk om de proteasebehandeling zorgvuldig te bewaken, omdat het succes van de elektroporatie afhangt van het verkrijgen van een celsuspensie die clusters van cellen bevat in plaats van enkelvoudige cellen. Controleer een druppel van 50 µL monster onder een omgekeerde lichtmicroscoop met een 4x objectief. Clusters van 10 tot 15 cellen zijn wenselijk, aangezien dit de celoverleving na elektroporatie verhoogt.

Breng de celсусpensie over naar een low-binding buis van 15 milliliter en stop de dissociatie door negen milliliter basaal medium zonder antibiotica toe te voegen. Centrifugeer dit bij 600 ×g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in één milliliter medium met verlaagd serumgehalte.

Tel het aantal cellen met een Bürker-telkamer; er zijn minimaal 1 × 10⁵ cellen nodig per electroporatiereactie. Begin deze procedure door 9 mL serumarm medium toe te voegen aan de 15 mL buis met de celsuspensie en centrifugeer dit 3 minuten bij 400 ×g op kamertemperatuur. Verwijder al het supernatant en resuspendeer de pellet in een electroporatie-oplossing.

Voeg in totaal 10 micrograms DNA toe aan twee nieuwe buisjes. Voeg vervolgens electroporatie-oplossing toe tot een eindvolume van 100 microliters en bewaar het cel-DNA-mengsel op ijs. Breng het cel-DNA-mengsel over naar de electroporatiecuvet en plaats de cuvet in de kamer van de electroporator.

Meet de impedantie door op de juiste knop van de electroporator te drukken en controleer of deze tussen de 0,030 en 0,055 ohm ligt. Voer de electroporatie uit volgens de instellingen die in het tekstprotocol worden aangegeven. Voeg 400 µL electroporatiebuffer met rock-inhibitor toe aan de cuvette en breng vervolgens de gehele inhoud over naar een 1,5 ml buisje.

Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te laten herstellen. Centrifugeer na 30 minuten gedurende drie minuten bij 400 ×g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 20 µL basement matrix per putje.

Zaai ongeveer 1 × 10⁴ tot 1 × 10⁵ cellen per put in een 48-well plaat en voeg medium toe met EGF plus noggin, GSK3-remmer, rock-remmer en 1,25% dimethylsulfoxide. Incubeer bij 37 °C. Vervang de volgende dag het medium door EGF plus noggin, GSK3-remmer en rock-remmer en controleer de transfectie-efficiëntie door de GFP-expressie waar te nemen.

Houd de organoïden op 37 °C. Vervang twee dagen later het medium door vers medium. Vier dagen na electroporatie wordt het medium gewisseld voor WENR plus nicotinamide en rock-inhibitor medium, waarna de cellen verder worden geïncubeerd op 37 °C.

De aanwezigheid van het juiste aantal gRNA-inserten in de concatemeer-vector wordt bevestigd door middel van een dubbele restrictiedigestie met EcoR1 en BglII. De verwachte grootte van de onderste band is ongeveer 1,6 kilobase voor een concatemeer-vector met vier gRNA's en 1,2 kilobase voor een concatemeer-vector met drie gRNA's. Daarnaast bevestigt digestie met Bbs1 dat de gRNA's in de juiste positie zijn gekloond en dat bijgevolg alle Bbs1-herkenningsplaatsen zijn verdwenen.

Bevestigde constructen worden via electroporatie afgeleverd in muis-intestinale organoïden om een transfectie-efficiëntie van maximaal 70% te bereiken, zoals aangetoond door GFP-expressie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe gRNA-concatemeer-vectoren worden gegenereerd en hoe deze efficiënt in 3D-organoïdeculturen worden afgeleverd middels electroporatie, om de knockout van meerdere genen tegelijkertijd te realiseren.