Een protocol voor meerdere gene-knock-out in muizen, kleine darmorganen, met behulp van een CRISPR-concatemer

Het algemene doel van dit protocol is om meerdere guide RNA's te klonen in één CRISPR-concatemer vector en om een zeer efficiënte elektroporering in muis darm organoïd te bereiken, om gelijktijdige knockout van meerdere genen te verkrijgen. Deze methode kan de efficiëntie van functieverliesstudies aanzienlijk verbeteren door het mogelijk te maken om het potentiële effect van parallelle compensatie te overwinnen. Het belangrijkste voordeel van onze CRISPR-concatemer strategie zijn de gemak van een enkele kloonstap en de mogelijkheid om gelijktijdige knockout van maximaal vier verschillende genen uit te voeren.

De procedure wordt gedemonstreerd door Alessandra Merenda, een PhD student uit mijn laboratorium. Het klonen van guide RNA's of gRNA's in de CRISPR-concatemer vector begint met een enkele reactie om de bovenste en onderste strengen voor elke gRNA oligonucleotide te annelen en om hun uiteinden te fosforyleren. Bereid de reactiemix op ijs, voor drie concatemers, gebruik drie microliter van de bovenste gRNA streng, drie microliter van de onderste gRNA streng, twee microliter van T4 DNA ligase buffer, één microliter van T4 polynucleotide kinase en water tot een totaal volume van 20 microliter.

Meng goed door middel van pipetteren en voer de thermocycler uit met de volgende instellingen, 37 graden Celsius gedurende 30 minuten, 95 graden Celsius gedurende vijf minuten, verlaag tot 25 graden Celsius met een snelheid van 0,3 graden Celsius per minuut en houd bij vier graden Celsius. De volgende stap is de Bbs1 shuffelingregaktie, waarin de vooraf geanneleerde gRNA oligonucleotiden in de juiste positie van de concatemer vector worden ingebouwd. Verdun de reactiemix een op 100 in DNA, RNA vrije water om drie en vier gRNA concatemer vectoren te genereren.

Assembleer de Bbs1 shuffelingregakties op ijs. Gebruik 100 nanogram van CRISPR-concatemer vector, 10 microliter van oligo mix, één microliter van restrictie-enzym buffer, één microliter van DTT, één microliter van ATP, één microliter van Bbs1 enzym, één microliter van T7 ligase en water tot een totaal volume van 20 microliter. Meng goed door middel van pipetteren, voeg een negatieve controle toe die de vector bevat.

Voer de reacties uit in een thermocycler, met de volgende instellingen, voor het klonen van drie en vier gRNA concatemers, voer 50 cycli uit bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten en 21 graden Celsius gedurende vijf minuten, houd bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten en houd vervolgens bij vier graden Celsius voor onbepaalde tijd. Voor twee gRNA concatemers, voer dezelfde instellingen uit met 25 cycli van stap één. Wanneer de Bbs1 shuffelingregaktie voltooid is, neem 11 microliter van elke ligatiemix en voeg 1,5 microliter van exonuclease buffer, 1,5 microliter van ATP, één microliter van DNA exonuclease en water toe tot een totaal volume van 15 microliter.

Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten gevolgd door 70 graden Celsius gedurende 30 minuten. Vervolgens wordt de reactiemix gebruikt om chemisch competente E.Coli bacteriën te transformeren, volgens een standaardprotocol. Om de aanwezigheid van gRNA invoegingen in de CRISPR-concatemer vector te bevestigen, pluk bacteriekolonies met een inoculerende lus en inoculeer elk in vier milliliter LB medium.

Laat de klonen een nacht groeien bij 37 graden Celsius in een orbitale shaker. De volgende dag wordt DNA geëxtraheerd met behulp van een plasmide miniprep kit, volgens de instructies van de fabrikant. Meng ongeveer 200 nanogram van elk DNA monster met 10 eenheden van EcoR1 en vijf eenheden van BglII in een 10 microliter reactie.

Voeg een aparte reactiemix toe met het overeenkomstige originele vector als positieve controle voor groottevergelijking. Incubeer de reacties bij 37 graden Celsius gedurende drie uur. Voer de verteringsreacties uit op een 1% agarose gel bij 90 volt gedurende ongeveer 20 minuten.

Visualiseer de gel met behulp van een UV transilluminator om de klonen met de juiste invoegselgrootte te identificeren. Om te bevestigen dat gRNA's in de juiste positie zijn gekloond en dat bijgevolg alle Bbs1 herkenningsplaatsen zijn verloren, verteer de geselecteerde klonen met vijf eenheden van Bbs1. Voeg een aparte reactiemix toe, met het overeenkomstige originele vector als controle.

Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende drie uur, voer de verteringsreacties uit op een 1% agarose gel bij 90 volt gedurende ongeveer 20 minuten. Visualiseer de gel met behulp van een UV transilluminator om de vectoren te identificeren die niet door Bbs1 zijn gesneden. Bij het splitsen van organoïd voor elektroporering, zaai een minimum van zes putjes van een 48-welplate per transvectie.

Zaai de organoïd in 20 microliter basement matrix druppels en laat ze groeien in 250 microliters van WENR plus nicotinamide medium per putje bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide in een bevochtigde incubator. Op dag twee, vervang het WENR plus nicotinamide medium met 250 microliters van EGF plus noggin, GSK3 remmer en rock remmer medium zonder antibiotica. Op dag drie, verander het organoid medium naar EGF plus noggin, GSK3 remmer, rock remmer en 1,25% dimethyl sulfaat zonder antibiotica.

Op dag vier, verstoor de basement matrix koepels, met behulp van een één milliliter pipette tip en breng organoïd over naar een 1,5 milliliter buis. Trek de inhoud van vier putjes van een 48-welplate in één buis. Breek de organoïd mechanisch in kleine fragmenten door op en neer te pipetteren met de P200 pipette ongeveer 200 keer.

Centrifugeer bij 600 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie, verwijder het medium van alle buisjes en re-suspendeer de paletten in één milliliter van een celcultuur graad recombinante protease. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende maximaal vijf minuten.

Het is belangrijk om de protease behandeling zorgvuldig te controleren omdat het succes van de elektroporering afhangt van het verkrijgen van een cellensuspensie die clusters van cellen bevat in plaats van enkele cellen. Controleer een 50 microliter druppel van monster onder een omgekeerde lichtmicroscoop met een viervoudige objectief. Clusters van 10 tot 15 cellen zijn wenselijk omdat dit de celoverleving na elektroporering verhoogt.

Breng de cellens