Name: Genetische manipulatie van primaire muis intestinale Organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes transductie virale vectoren voor bevroren snijden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Leer genetische manipulatie van primaire muis darmorganoïden met magnetische nanodeeltjes en virale vectoren voor bevroren sneden. Deze methode maakt efficiënte transductie mogelijk met lage cytotoxiciteit voor functionele studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door subsidies van het National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), het Maryland stamcel Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), de American Lung Association, het Allegheny Health Network-Johns Hopkins Research Fund en de Hopkins spijsverterings ziekten Basic Research core Center.

Dit protocol werd goedgekeurd door de Johns Hopkins Medical instellingen Animal Care en use Committee (IACUC). Dit protocol is gewijzigd van een eerder gepubliceerde methoden10,11,12,13.
1. bereiding van de reagentia
<ol><li>Bereid vers 293T medium enkele uren van tevoren en warm tot 37 °C in een waterbad gedurende ten minste 10 minuten voor gebruik (tabel 1).</li>
	<li>Bereid plasmide DNA2,13,14 voor virale verpakking. (Tabel 2).</li>
	<li>Verkrijg alle andere vereiste materialen (tabel met materialen).</li>
</ol>2. lentivirus-of retrovirus deeltjes productie
<ol><li>Menselijke embryo nier (HEK) 293T celseeding (Dag 1)
	<ol>
<li>Bereid 1 150 mm kweek schaal met coating met 50 μg/mL poly-D-Lysine opgelost in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 10 mL/schotel) voor 1 uur bij kamertemperatuur (RT).</li>
		<li>Verwijder de fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)/poly-D-lysine en was de gecoate schotel tweemaal met 5 mL PBS.</li>
		<li>Zaad 293T cellen (8 \ u201210 x 106) in 293t medium (tabel 1) tot een totaal volume van 15 ml.</li>
		<li>Cultuur 293T cellen overnachten in een standaard weefselkweek incubator (37 °C, 5% CO2).</li>
	</ol></li>
	<li>HEK 293T celtransfectie (dag 2)
	<ol>
<li>Voer transfectie zodra cellen hebben bereikt 70-80% samenloop (meestal ongeveer 24 h na zaaien 8 \ u201210 x 106 cellen).</li>
		<li>Bereid transfectie mengsel met behulp van een efficiënte aanpak, zoals een commerciële kationische liposoom formulering (tabellen 1 \ u20122, tabel van de materialen)2.<ol>
<li>Verdun lentivirus DNA constructies12 (totaal ~ 24 μg plasmide DNA, tabel 2) in 1,2 ml transfectie medium en inincuberen gedurende 5 min bij RT in 1,5 ml buizen (tabel van de materialen).</li>
			<li>Verdun transfectie regent (36 μL) in 1,2 mL transfectie medium (tabel met materialen) en inincuberen in 5-ml buisjes gedurende 5 min volgens de instructies van de fabrikant.</li>
			<li>Voeg het lentivirusreagens (stap 2.2.2.1) toe aan het transfectie-reagens (stap 2.2.2.2) en meng zachtjes met een pipet van 5 ml met langzaam pipetteren.</li>
			<li>Inbroed het mengsel gedurende 20 minuten bij RT.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Spoel 293T cellen voorzichtig af met 5 mL transfectie medium en vervang deze door 10 mL transfectie medium.</li>
		<li>Voeg de DNA-lipide-complexen (van stap 2.2.2.3) druppelsgewijs toe aan het medium van 293t cellen en meng de media zorgvuldig in de cultuur gerechten door horizontale en verticale richtingen te bewegen om gelijke verdeling van de DNA-lipidecomplexen in elk gerecht te garanderen.</li>
		<li>Incueren voor 6 h in een standaard incubator voor weefselkweek (37 °C, 5% CO2).</li>
		<li>Na incubatie, de media vervangen door 20 mL vers virus opvang medium (tabel 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Virus Collection (dagen 3 \ u20125)
	<ol>
<li>Verzamel virus media in buizen van 50 mL en bewaar in een koelkast van 4 °C voor verdere concentratie.</li>
		<li>Vervang 20 mL vers virus opvang medium elke 24 uur en cultuur 's nachts (~ 24 uur). Herhaal de mediaverzameling gedurende de volgende 2 dagen (dagen 4 \ u20125).</li>
		<li>Zorg ervoor dat de totale hoeveelheid medium verzameld na dag 5 is ~ 60 mL (20 mL/dag x 3 dagen).</li>
	</ol></li>
	<li>Virus concentratie (dag 5)
	<ol>
<li>Centrifugeer de verzamelde media (60 mL) gedurende 5 min bij 400 x g. Vervolgens passeert u het supernatant door een filter (poriën van 0,45 μm) om celresten te verwijderen.</li>
	</ol></li>
	<li>Concentreer het virus door 15 mL gefilterde virus media toe te voegen in een centrifugale filter Unit (tabel met materialen). Centrifugeer bij 2.500 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c. Omdat het virus dit filter niet kan passeren, zal het geconcentreerd worden in de bovenste kamer van het filter.
	<ol>
<li>Zuig de doorstroming van de buis (onderste kamer) en voeg nog eens 15 mL overgebleven virale inzamel media supernatant toe aan dezelfde centrifugale filter unit. Centrifugeer zoals hierboven (2.500 x g gedurende 15 minuten bij 4 °c) om extra virus van het supernatant te concentreren.</li>
		<li>Herhaal het proces met behulp van hetzelfde filter voor 60 mL media van een enkele getransduceerde plaat tot de gewenste concentratie is bereikt (~ 100-fold). Opmerking: we concentreren ons meestal ~ 60 mL van de virus verzamelings media tot ~ 600 μL.</li>
		<li>Verwijder het geconcentreerde virus uit de bovenste kamer van het filter met behulp van een pipet van 1 mL, vervolgens aliquot en bewaar in 1,5 mL buisjes (50 \ u201260 μL/buis) bij-80 °C voor later gebruik. Bewaar geconcentreerde deeltjes tot 6 \ u201212 maanden.</li>
	</ol></li>
</ol>3. isoleren crypten
<ol><li>Euthanize muizen met behulp van CO2 volgens de lokale IACUC richtlijnen.</li>
	<li>Plaats het geëeuthaniseerde dier op zijn rug en was de buik door te spuiten met 70% ethanol.</li>
	<li>Voer een longitudinale middenlijn incisie van het borstbeen naar de lies, insnijding van de huid eerst, en vervolgens het subcutane weefsel.</li>
	<li>Verwijder de dunne darm van de maag naar de Cecum.</li>
	<li>Identificeer regio's van belang binnen de dunne darm; crypten kunnen worden geïsoleerd uit de twaalfvingerige darm, jejunum en ileum.</li>
	<li>Spoel met een injectiespuit van 10 ml de geïsoleerde dunne darm met een crypt dissociatie buffer (voorgekoelde PBS met 1 mm dithiotreïtol (DTT), 1% penicileen/streptomycine (no CA2 + en mg2 +)) in een 10 cm-weefselkweek schaal (tabel 1)</li>
	<li>Verwijder perifeer vetweefsel en open of "filet" het darmweefsel longitudinaal op een steriele glazen plaat (15 cm x 15 cm).</li>
	<li>Schrapen de intestinale epitheliale Villi voorzichtig met behulp van een celscraper.</li>
	<li>Snijd de dunne darm in 2 \ u20123 cm lengte-Wise secties.</li>
	<li>Breng het weefsel over in een buis van 15 mL die voorgekoelde PBS met platte Tang (116 mm) bevat. Was de weefsel fragmenten door krachtig schudden met de hand voor ~ 30 s (verplaatsen van de buis in tegengestelde richtingen ~ 60 keer).</li>
	<li>Vernieuw de PBS en herhaal wassen totdat de PBS duidelijk wordt. Opmerking: we wassen meestal de fragmenten 2 \ u20123 keer.</li>
	<li>Inbroed het weefsel in een conische buis van 15 mL met 10 mL crypt dissociatie buffer (tabel 1) gedurende 10 minuten bij 4 °c op een rondschudapparaat met een gemiddelde snelheid zodra de PBS helder is.</li>
	<li>Schud de buis krachtig met de hand voor ~ 30 s (tegenovergestelde richtingen ≈ 60 keer) en breng het weefsel over met platte Tang naar een andere conische buis van 15 mL met 10 mL crypte dissociatie buffer. Incuberen deze breuk op ijs. Gebruik de eerste fractie niet voor de organoïde cultuur omdat deze voornamelijk Villi bevat.</li>
	<li>Herhaal stap 3.11 \ u 20123.13 voor 3 \ u20124 keer, het verzamelen van elke breuk en het plaatsen van hen op ijs.</li>
	<li>Selecteer de breuk die is verrijkt met het hoogste percentage intestinale crypten door het scannen van 200 μL monsters van elke fractie onder een omgekeerde Microscoop (4x). Identificeer crypten door de typische morfologie zoals eerder beschreven (Figuur 1a)10. Opmerking: Ze verschijnen rond of ovaal in vorm en bevatten gegranuleerde Paneth cellen. Villi daarentegen zijn vingerachtige structuren zonder de korrelige Paneth cellen (Figuur 1b).</li>
	<li>Geef de geselecteerde breuk door een 40 μm celzeef om crypten van vergelijkbare grootte te verkrijgen indien nodig. U ook Lgr5 + stamcellen isoleren op basis van Flowcytometrie voor groene fluorescerende eiwitten (GFP) als muizen worden gekruist op de EGFP-Lgr5 + achtergrond of een ander geschikt model dat identificatie van Lgr5 + cellen2mogelijk maakt.</li>
	<li>Tel het totale aantal crypten in de geselecteerde breuk als volgt.
	<ol>
<li>Pipetteer 50 μL van de geselecteerde Fractie in een hemocytometer en Tel het aantal crypten met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop (4x). Plaats ~ 100 crypten per put bij het gebruik van een 48-Wells plaat om toe te staan voor de transductie experimenten waarin 3 \ u20126 putten zullen worden getransduceerde per experimentele toestand voor gen uitschakeling of overexpressie.</li>
		<li>Op basis van het aantal crypten per 50 μL, bereken het volume van de Crypt dissociatie buffer nodig en breng dat volume over in een buis van 1,5 mL. Opmerking: bijvoorbeeld, 10 crypten per 50 μL worden geteld, 6 x 50 μL of 300 μL zijn nodig voor 300 crypten.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugeer de crypten in de 1,5-mL tubes bij 300 x g gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Gooi het supernatant voorzichtig weg door de bovenste vloeistof laag zachtjes te pipetteren en breng de pellet in 100 μL groeifactor verlaagde kelder membraan matrix op ijs (tafel van materialen).</li>
	<li>Zaai de matrix-bevattende crypten in een 37 °C voorverwarmde 48-goed plaat (30 μL/goed, ~ 100 crypten/goed). Incueren van de plaat in een standaard weefselkweek incubator voor 5 \ u201215 min voor het toestaan van matrix gelatie (37 °C, 5% CO2).</li>
	<li>Overlay elke gel met 250 μL organoïde Culture (ENR) medium (tabel 1) en plaats de 48-well-platen terug in een standaard incubator voor weefselkweek (37 °c, 5% Co2). Controleer de culturen voor crypt organisatie in kleine, ronde, cystische vormen na 24 h; knoppen worden na 2 \ u20125 dagen vorm.</li>
	<li>Vervang de ENR-media voorzichtig elke 3 dagen. Verwijder oude ENR-media met zachte zuigkracht, zorg dat u de matrix niet aanraakt bij het vervangen van media.</li>
	<li>Passage organoïde culturen elke 4 \ u20127 dagen zoals eerder beschreven11.</li>
</ol>4. voorbereiding organoïde fragment
<ol><li>Het vormen van organoïden zodra ze vorm hebben (binnen 1 \ u20122 weken) of nadat ze zijn gepasseerde. Voor een enkele transductie-experiment, bereid 2 \ u20123 putten van gekweekte organoïden in een 48-goed plaat per aandoening met ~ 100 \ u2012200 organoïden/goed of ~ 200 \ u2012600 organoïden per experimentele transductie conditie.</li>
	<li>Exchange ENR met 250 μL transductie media (tabel 1) en cultuur in de transductie media gedurende 3 of meer dagen of totdat de organoïden een Cystic morfologie aannemen. Zowel Wnt3a als ROCK remmer (Y27632) in het transductie medium opnemen om het aantal stam-en Paneth cellen te verhogen; Nicotinamide (NIC) verbetert de efficiëntie van de cultuur (Zie transductie medium in tabel 1).</li>
	<li>Mechanisch ruptuur de koepel-achtige kelder membraan matrixstructuur met media en een pipetpunt met behulp van een 1 mL pipet.</li>
	<li>Breng de organoïden en de media over naar een steriele 1,5 mL Tube.</li>
	<li>De matrix verder mechanisch verstoren door pipetteren met een pipet van 200 μL ~ 10 \ u201215 keer.</li>
	<li>Centrifugeer de organoïde fragmenten bij RT bij 500 x g gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Gooi het supernatant voorzichtig weg met een pipet en regeer de pellet in 1 mL DMEM/F12 medium (tabel 1).</li>
	<li>Voeg Dispase I (6 μL bij 10 mg/mL) en DNase I (2,5 μL bij 10 mg/mL) toe. Meng goed door Pipetteer zachtjes met een pipet van 1 mL.</li>
	<li>Inincuberen organoïden bij 37 °C gedurende 20 minuten in de buis van 1,5 mL.</li>
	<li>Voeg 500 μL ENR-media toe om de dissociatie reactie te beëindigen; het serum in de ENR beëindigt de reactie.</li>
	<li>Passeer de organoïde cellen door een celzeef van 20 μm en centrifugeer de organoïde fragmenten gedurende 5 minuten bij 400 x g .</li>
	<li>Respendeer organoïde fragmenten met 150 μL transductie medium (tabel 1).</li>
</ol>5. genetische manipulatie van Organoïden of crypte cellen door virale transductie
Opmerking: Zie Figuur 2.
<ol><li>Zaad organoïde-celclusters met 200 μL transductie medium/well in een 48-well-plaat en incueren in een standaard kweek-incubator (37 °c, 5% Co2). U ook vers geïsoleerde crypt cellen (~ 1.000 crypten) in 200 μL transductie medium/well in een 48-well-plaat plaatsen en incueren in een standaard kweek-incubator (37 °C, 5% CO2).</li>
	<li>Ontdooien injectieflacons met virus voor transductie voor ~ 50 μL geconcentreerd virus voor transductie van elk goed in 48-put platen of ~ 100 μL geconcentreerd virus per put in 24-Well platen.</li>
	<li>Incuberen virus met 12 μL magnetische nanodeeltjes oplossing gedurende 15 minuten bij RT in een buis van 1,5 mL (tabel 3).</li>
	<li>Voeg de magnetische nanodeeltjes oplossing/virus mengsel toe aan de cellen die moeten worden transduced.</li>
	<li>Plaats de celkweek plaat op een magnetische plaat en inculeer gedurende ten minste 2 uur (en tot ~ 6 h) in een standaard kweek couveuse (37 °C, 5% CO2).</li>
</ol>6. zaaien van geïnfecteerde Organoïde fragmenten
<ol><li>Breng de geïnfecteerde organoïde celclusters en transductie media van elke put over in een tube van 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Gooi het supernatant met zachte zuigkracht weg en koel de buis met de pellet op ijs gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Voeg 120 μL van de kelder membraan matrix toe en breng de pellet door en Pipetteer langzaam op en neer.</li>
	<li>Zaad 30 μL druppels van het matrix-celmengsel in een nieuwe 48-well plaat.</li>
	<li>Inincuberen van de plaat bij 37 °C gedurende 5 \ u201215 min totdat de matrix stolt.</li>
	<li>Voeg transductie medium toe aan elk goed en incueren in een standaard weefselkweek incubator voor 3 \ u20124 dagen (37 °C, 5% CO2).</li>
	<li>Inspecteer na 3 \ u20124 dagen culturen onder een lichte Microscoop (10x) om de organisatie van celclusters in organoïde structuren te verzekeren. Vervang vervolgens de transductie media voorzichtig door 250 μL ENR medium.</li>
	<li>Vervang media elke 3 \ u20124 dagen.</li>
</ol>7. selectie (indien van toepassing)
<ol><li>Voeg na 2 \ u20123 dagen relevante antibiotica of hormonen toe voor selectie naar het transductie medium, indien van toepassing. Opmerking: We gebruikten puromycine (2 μg/ml) voor de selectie van de lentivriale transductie omdat plasmiden een puromycine resistentie gen2,14verveeld.</li>
</ol>8. bevestiging van succesvolle transductie en genexpressie of uitschakeling
<ol><li>Bij gebruik van fugw lentivirus2,14, schatting transductie efficiëntie door het meten van GFP signalen via fluorescerende Microscoop of flow cytometrie.</li>
	<li>Valideer genen overexpressie of uitschakeling met behulp van kwantitatieve reverse transcriptase polymerase kettingreactie (RT-PCR) voor kwantitatieve vergelijking van mRNA in de controle en experimentele organoïde culturen.</li>
	<li>Bevestig de eiwit niveaus voor genexpressie of uitschakeling door Western Blot of immunokleuring2met eiwit codering.</li>
</ol>9. organoïde Cryosectie in kelder membraan matrix
Opmerking: Zie Figuur 3.
<ol><li>Verwijder ENR medium door zachte zuigkracht, wees voorzichtig niet te perturb de kelder membraan matrix en voorzichtig wassen eenmaal met 500 μL PBS.</li>
	<li>Repareer organoïden met 1,0 mL 4% Paraformaldehyde (PFA) oplossing (tabel met materialen) bij RT gedurende 30 min.</li>
	<li>Verwijder PFA door afzuiging en spoel zachtjes tweemaal met 1 mL PBS.</li>
	<li>Verwijder PBS door afzuigen en voeg 1,0 mL 30% sacharose buffer toe aan elk monster. Incuberen vaste organoïden in sucrose gedurende 1 uur bij 4 °C in een koude ruimte, koelkast of op ijs om monsters te dehydraat.</li>
	<li>Verwijder de sacharose buffer door afzuiging en voeg net genoeg insluit verbinding (Inhoudsopgave) toe om de matrix laag (~ 300 μL/well) in elke put te bedekken.</li>
	<li>Incuberen bij RT gedurende 5 min.</li>
	<li>Plaats de monsters in een vriezer van 80 °C gedurende 10 minuten, of totdat de inbedding vast en wit brandt.</li>
	<li>Plaats de schaal met bevroren insluitings verbinding bij RT om het minimale smelt van de verbinding langs de randen mogelijk te maken. Gebruik een scalpel om het blok van de wanden van de put te scheiden.</li>
	<li>Verwijder het samengestelde blok met behulp van een tang en plaats het in een preparaat blok (bv. cryomold), dat snel werkt om smelten te voorkomen.</li>
	<li>Vul de mal volledig met insluitings verbinding en Vries gedurende 30 minuten bij-80 °C.</li>
	<li>Gebruik het blok is voor het snijden of opslaan in-80 °C vriezer voor verder gebruik.</li>
</ol>

<ol><li>Cheung, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGAR+is+required+for+efficient+intestinal+regeneration+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis.</a> Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).</li>
<li>Xian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGA1+amplifies+Wnt+signalling+and+expands+the+intestinal+stem+cell+compartment+and+Paneth+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Comm%22%5BJournal%5D)">HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche.</a> Nature Comm. , (2017).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li>
<li>Kabiri, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroma+provides+an+intestinal+stem+cell+niche+in+the+absence+of+epithelial+Wnts%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts.</a> Development. 141, 2206-2215 (2014).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids%3A+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li>
<li>Muñoz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lgr5+intestinal+stem+cell+signature%3A+robust+expression+of+proposed+quiescent+%27%2B4%27+cellmarkers%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers.</a> EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).</li>
<li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR%2FCas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765(2014).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).</li>
<li>Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+transduction+of+mouse+and+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells.</a> Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).</li>
<li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li>
<li>Tesfaye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+High-Mobility+Group+A1+gene+up-regulates+Cyclooxygenase-2+expression+in+uterine+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis.</a> Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).</li>
<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+infection+of+cell+cultures+by+magnetically+controlled+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus.</a> J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).</li>
<li>Xue, X., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+organoid+culture+of+primary+mouse+colon+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors.</a> J Vis Exp. (75), e50210(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Primaire cultuur van volwassen intestinale epitheel als organoïden biedt een krachtig hulpmiddel om moleculaire mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij stamcel functie, intestinale epitheliale homeostase en pathologie1,2,3, 4. Hoewel CRISPR/Cas9 technologie kan worden gebruikt voor genetisch gemanipuleerde organoïden9, wordt het beperkt door de noodzaak van uit...

De mogelijkheid om te cultuur muis of menselijke crypten cellen als driedimensionale (3D) organoïden uit de dunne darmen of dikke darm over langere tijd perioden voorzien van een grote doorbraak, omdat deze culturen weergeven definiëren kenmerken van intestinale epitheel in vivo 1 , 2 , 3. organoïden afgeleid van primaire crypten zijn in staat om zelf vernieuwing en zelforganisatie, exposeren cellulaire functies vergelijkbaar met hun weefsels van oorsprong. Inderdaad, organoïden recapituleren niet alleen de structurele organisatie van crypten in vivo, maar ook veel moleculaire kenmerken, waardoor het verstrekken van nuttige instrumenten om normale biologie en ziektetoestanden te bestuderen. Ter illustratie, organoïde studies hebben aangetoond dat nieuwe moleculaire trajecten die betrokken zijn bij weefselregeneratie1,2,3,4,5 en geneesmiddelen die de functie kunnen verbeteren in pathologische instellingen6,7.
De studie van intestinale stamcellen is van bijzonder belang omdat de intestinale voering behoort tot de meest zeer regeneratieve zoogdier weefsels, die zich elke 3-5 dagen vernieuwt om het organisme te beschermen tegen bacteriën, toxines en andere pathogenen binnen de intestinale lumens. Intestinale stamcellen (iSCS) zijn verantwoordelijk voor dit opmerkelijke regeneratieve vermogen en bieden zo een uniek paradigma voor het bestuderen van de volwassen stamcel functie1,2. Lineage-tracing experimenten bij muizen toonden aan dat geïsoleerde Lgr5-positieve stamcellen gekweekt kunnen worden om 3D-organoïden of ' mini-Guts ' in vitro te genereren, waar ze hun in vivo-tegenhangers nauwkeurig weerspiegelen. Organoïde culturen kunnen ook worden afgeleid van intestinale crypte van cellen die bestaan uit voor ouders, ISCs en Paneth, waarvan de laatste de epitheliale niche cellen in vivo vormen. In feite is de organoïde cultuur uit primaire intestinale crypte cellen geëvolueerd tot een relatief routinematige techniek die gemakkelijk te implementeren is in de meeste laboratoria met behulp van algemeen beschikbare reagentia. Dit model is ook vatbaar voor kwantitatieve analyse van genexpressie door RNA-sequencing (RNA-SEQ) en eiwitten door massaspectrometrie, Immunohistochemie of immunofluorescentie kleuring2,4,8. Daarnaast kan functionele genetica worden bestudeerd met behulp van gain-of-function (gen-overexpressie of expressie van een activerend Mutant gen) of verlies van functie (gen-uitschakeling of expressie van een verlies-van-functie Mutant) benaderingen2.
Belangrijk, laag rendement en hoge toxiciteit van standaard plasmide DNA of virale transductie protocollen met polybrene blijven een grote hindernis in het veld. Hoewel CRISPR/Cas9 technologie een precieze genoom bewerking mogelijk maakt, vereist deze aanpak tijdrovende selectie gevolgd door sequentie validatie9. Hier presenteren we een virale transductie protocol voor primaire intestinale organoïden dat de levering van virale deeltjes optimaliseert door conjugatie aan magnetische nanopartikels en de toepassing van een magnetisch veld. Belangrijke wijzigingen in de voorafgaande protocollen4,5,10,11,12,13 en aanbevelingen ter verbetering van de efficiëntie worden verstrekt. We beschrijven ook een aanpak voor het genereren van bevroren secties van intacte organoïden gekweekt in 3D matrigel (hierna te noemen kelder membraan matrix of matrix) voor verdere analyse met immunohistochemie of immunofluorescentie kleuring.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>Basismedium voor 293T-cellen</td></tr><tr><td>DMEM/F12+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634010</td><td>Basismedium voor organoïdcultuurmedium en organoïddigestiebuffer</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td>Transfectiemedium voor virusplasmiden</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td>Component van viruscollectiemedium en 293T-medium</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Component van organoïdcultuurmedium en crypt-dissociatiebuffer</td></tr><tr><td>PBS (zonder Ca2+, Mg2+)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>Een wasbuffer en component van crypt-dissociatiebuffer</td></tr><tr><td>Mem-NEAA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td>Component van organoïdcultuurmedium</td></tr><tr><td>GlutamaxII</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Component van organoïdcultuurmedium</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Component van organoïdcultuurmedium</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Millipore Sigma</td><td>E9644</td><td>Component van organoïdcultuurmedium</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38 B</td><td>Component van organoïdcultuurmedium</td></tr><tr><td>R-spondin</td><td>R&amp;D</td><td>7150-RS-025/CF</td><td>Component van organoïdcultuurmedium</td></tr><tr><td>Human recombinant insulin</td><td>Millipore Sigma</td><td>I9278-5ml</td><td>Component van organoïdcultuurmedium</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Millipore Sigma</td><td>N3376-100G</td><td>Component van Transductiemedium</td></tr><tr><td>Wnt3A</td><td>R&amp;D</td><td>5036-WN-010</td><td>Component van Transductiemedium</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Millipore Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td>Component van Transductiemedium</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>Component van Crypt-dissociatiebuffer</td></tr><tr><td>DTT (dithiothreitol)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td>Component van Crypt-dissociatiebuffer</td></tr><tr><td>Dispase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4818-2MG</td><td>Component van organoïddigestiebuffer</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>11284932001</td><td>Component van organoïddigestiebuffer</td></tr><tr><td>matrigel(Growth factor reduced)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Gebruikt als een matrix om organoïdjes in te bedden</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Medium voor transfectie bij virale productie</td></tr><tr><td>ViralMag R/L</td><td>Oz Biosiences</td><td>RL40200</td><td>Magnetische deeltjes voor virale transductie</td></tr><tr><td>Magnetic plate</td><td>Oz Biosiences</td><td>MF10000</td><td>Magnetische plaat om virale transductie te vergemakkelijken</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Transfectiemiddel bij virale productie</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Millipore Sigma</td><td>A-003-E</td><td>Coating voor platen voor het zaaien van 293T-cellen</td></tr><tr><td>4% Formaldehyde Solution</td><td>Boster</td><td>AR1068</td><td>Oplossing om organoïdjes te fixeren</td></tr><tr><td>O.C.T embedding compound</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4583S</td><td>Voor het inbedden van de organoïdjes</td></tr><tr><td>5 mL Falcon polystyrene tubes</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon Tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.100</td><td></td></tr><tr><td>Orbitron rotator II Rocker Shaker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260250</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Inverted microscop CK30</td><td>Olympus</td><td>CK30</td><td>voor het scannen en tellen van crypts</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence</td><td>Nikon</td><td>Axiovert 200</td><td>voor het bekijken van fluorescentie in de crypts</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane</td><td>Milipore Sigma</td><td>UFC910024</td><td>Voor het concentreren van virussen</td></tr><tr><td>pluriStrainer 20 &micro;m (Cell Strainer)</td><td>pluriSelect</td><td>SKU 43-50020</td><td>Voor het bereiden van organoïdfragmenten</td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>352340</td><td>Voor het bereiden van crypts van vergelijkbare grootte na crypt-isolatie</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&nbsp;multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid)</td><td>Millipore Sigma</td><td>M8937-100EA</td><td>Voor D2:D37+D16:D37g organoïdfragmenten</td></tr><tr><td>Animal strain: C57BL/6J</td><td>Jackson Lab</td><td>#000664</td><td>Voor organoïdcultuur</td></tr></tbody></table>

genetische manipulatie van primaire muis intestinale organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes transductie virale vectoren voor bevroren snijden

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinale organoïde culturen bieden een unieke kans om te onderzoeken intestinale stamcel en crypt biologie in vitro, hoewel efficiënte benaderingen voor het manipuleren van genexpressie in organoïden beperkte vooruitgang in deze arena hebben gemaakt. Hoewel crispr/Cas9 technologie het mogelijk maakt om cellen te bewerken voor organoïde generatie, vereist deze strategie een uitgebreide selectie en screening door sequentieanalyse, wat zowel tijdrovend als kostbaar is. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor efficiënte virale transductie van intestinale organoïden. Deze aanpak is snel en zeer efficiënt, waardoor de tijd en kosten die inherent zijn aan CRISPR/Cas9 technologie afnemen. We presenteren ook een protocol voor het genereren van bevroren delen van intacte organoïde culturen voor verdere analyse met immunohistochemische of immunofluorescentie kleuring, die kan worden gebruikt om genexpressie of uitschakeling te bevestigen. Na succesvolle transductie van virale vectoren voor genexpressie of geluids dempings wordt bereikt, kunnen de intestinale stamcel en de crypte functie snel worden beoordeeld. Hoewel de meeste organoïde-onderzoeken in vitro testen gebruiken, kunnen organoïden ook bij muizen worden afgeleverd voor in-vivo-functionele analyses. Bovendien zijn onze benaderingen voordelig bij het voorspellen van therapeutische reacties op geneesmiddelen, omdat momenteel beschikbare therapieën doorgaans functioneren door het moduleren van genexpressie of eiwit functie in plaats van het genoom te veranderen.

Hier beschrijven we een snelle en zeer efficiënte transductie techniek die magnetische nanodeeltjes die worden blootgesteld aan een magnetisch veld, maakt om lentivirus aan cellen van belang te leveren. Met gemakkelijk verkrijgbare hulpmiddelen hebben we deze aanpak niet alleen toegepast om vers geïsoleerde crypt cellen (Figuur 1a) te leiden, maar ook voor organoïden (Figuur 2) en andere cellen die ongevoelig zijn voor meer routi...

We beschrijven stap-voor-stap instructies voor: 1) efficiënt ingenieur intestinale organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes voor Lenti-of retrovirale transductie, en, 2) het genereren van bevroren secties van engineered organoïden. Deze aanpak biedt een krachtig hulpmiddel om de genexpressie in organoïden efficiënt te veranderen voor onderzoek naar stroomafwaartse effecten.

Genetische manipulatie van primaire muis intestinale Organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes transductie virale vectoren voor bevroren snijden

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Omdat organoïden de inheemse structurele organisatie samenvatten, evenals vele moleculaire kenmerken van darmeptheel in vivo, stelt deze techniek ons in staat om normale biologie en ziektetoestanden in het laboratorium te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het vermogen om organoïden genetisch te manipulatie met behulp van een zeer efficiënte transductiebenadering met lage cytotoxiciteit, waardoor functionele studies van deze genetisch gemanipuleerde organoïden mogelijk zijn. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot therapie voor darmziekten omdat we darmorganoïden kunnen blootstellen aan medicijnen en andere middelen of interventies.Deze methode kan worden toegepast op het bestuderen van ontwikkelings- en pathologische processen in andere systemen die vatbaar zijn voor organoïde culturen, zoals borstweefsels of voor cellen die groeien onder standaard 2D-omstandigheden. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn bij deze methode slagen met transductie in moeilijk te ontwerpen organoïden of andere cellen. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we problemen ondervonden bij het transduceren van onze organoïden en stamcelle

genetic-engineering-primary-mouse-intestinal-organoids-using-magnetic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit artikel en de bijbehorende video presenteren ons protocol voor het genereren van weefsel-engineered darm in muizen, waarbij een organoid units-on-scaffold benadering.

Tissue Engineering van de darm in een muizenmodel

Bron: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015)Deze video beschrijft de lentivirale transductie van muis-intestinale organoïden vanuit een suspensie die crypt-achtige structuren bevat. Met behulp van een basaalmembraanmatrix als steunstructuur en medium aangevuld met groeifactoren worden lentivirale vectoren geïntroduceerd om stabiele genintegratie mogelijk te...

Genoverdracht naar intestinale organoïden van muizen met behulp van lentivirale vectoren

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

Een eenvoudige methode om primaire murine colon tumor organoïde stellen beschreven. Deze methode maakt gebruik van de functie die colon tumorcellen overleven en te groeien in organoids in media die beperkte groei factoren, terwijl de normale colon epitheel niet doen.

In vitro organoïde Cultuur van primaire Mouse Colon Tumoren

Dit protocol legt de primaire Lgr5-positve organoïde cultuur en de daaropvolgende prestaties van retrovirale transductie. Dit maakt Cre-induceerbare overexpressie of knock-down van de geleverde transgen en maakt de functionele studies die in de roman worden uitgevoerd in vitro organotypisch   modelsysteem.

Een video Protocol van retrovirale infectie in het jeugdwerk Intestinale organoïde Cultuur

In dit videoprotocol geven we een stapsgewijze uitleg van lentivirale transductie in organoïden van primair darm epitheel en van verwerking en downstream analyse van deze culturen door kwantitatieve RT-PCR, RNA-microarray en immunohistologie.

Een protocol voor Lentiviral Transduction en Downstream Analyse van Intestinale Organoids

Hier wordt een protocol te oogsten, te onderhouden en te behandelen muis dunne darm organoids met pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en Listeria monocytogenes beschreven, alsmede nadruk op genexpressie en correcte normalisatie technieken voor eiwit.

De<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultuur en Pattern Recognition Receptor Stimulatie van de Muis Intestinal Organoids

Dit protocol beschrijft de stappen voor het kloneren van meerdere single-guide RNA's in een RNA-concatemervector, die bijzonder geschikt is voor het creëren van multi-gen-knockouts met behulp van CRISPR / Cas9-technologie. De opkomst van dubbele knockouts in darmorganoïden wordt getoond als een mogelijke toepassing van deze methode.

Een protocol voor meerdere gene-knock-out in muizen, kleine darmorganen, met behulp van een CRISPR-concatemer

Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het vaststellen van muriene dunne darm organoïden, het isoleren van type-1 aangeboren lymfoïde cellen uit de muriene dunne darm lamina propria, en het vaststellen van 3-dimensionale (3D) co-culturen tussen beide celtypen om bi-directionele interacties tussen intestinale epitheelcellen en type-1 aangeboren lymfoïde cellen te bestuderen.

Co-cultuur van murine dunne darm epitheliale organoïden met aangeboren lymfoïde cellen

Hier presenteren we een protocol om darmorganoïden van ratten te genereren en deze te gebruiken in verschillende stroomafwaartse toepassingen. Ratten zijn vaak een geprefereerd preklinisch model, en het robuuste intestinale organoïdesysteem voorziet in de behoefte aan een in vitro systeem om in vivo studies te begeleiden.

Generatie en manipulatie van darmorganoïden van ratten

We beschrijven confocale beeldvormings- en volgpijplijnen toegepast op twee rapportagestrategieën: mozaïekorganoïden voor het oplossen van individueel celgedrag en lotsreporterorganoïden voor het monitoren van celtypeovergangen in menselijke en muis-intestinale organoïden.

Levende-cel beeldvorming en single-cel tracking om klonale dynamiek en lotsovergangen in menselijke en muisachtige intestinale organoïden te monitoren

Leer genetische manipulatie van primaire muis darmorganoïden met magnetische nanodeeltjes en virale vectoren voor bevroren sneden. Deze methode maakt efficiënte transductie mogelijk met lage cytotoxiciteit voor functionele studies.

Genetische manipulatie van primaire muis intestinale Organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes transductie virale vectoren voor bevroren snijden (Video) | JoVE Journal

Genetische manipulatie van primaire muis intestinale Organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes transductie virale vectoren voor bevroren snijden

Meer video's verkennen