Genetische manipulatie van primaire muis intestinale Organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes transductie virale vectoren voor bevroren snijden

Omdat organoïden de inheemse structurele organisatie samenvatten, evenals vele moleculaire kenmerken van darmeptheel in vivo, stelt deze techniek ons in staat om normale biologie en ziektetoestanden in het laboratorium te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het vermogen om organoïden genetisch te manipulatie met behulp van een zeer efficiënte transductiebenadering met lage cytotoxiciteit, waardoor functionele studies van deze genetisch gemanipuleerde organoïden mogelijk zijn. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot therapie voor darmziekten omdat we darmorganoïden kunnen blootstellen aan medicijnen en andere middelen of interventies.

Deze methode kan worden toegepast op het bestuderen van ontwikkelings- en pathologische processen in andere systemen die vatbaar zijn voor organoïde culturen, zoals borstweefsels of voor cellen die groeien onder standaard 2D-omstandigheden. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn bij deze methode slagen met transductie in moeilijk te ontwerpen organoïden of andere cellen. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we problemen ondervonden bij het transduceren van onze organoïden en stamcellen.

Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang als structureel verlies van de organoïden kan optreden als monsters niet goed worden behandeld tijdens het inbeddingsproces in de kelder matrix voor cryosectioning. Om organoïden te kweken voor virale transductie, zaad organoïde celculturen met 200 microliters van transductie medium per put in een 48-well plaat, en incubeer in een standaard weefsel cultuur incubator. Dooi flacons van virus voor transductie, waardoor ongeveer 50 microliter geconcentreerd virus voor de transductie van elke put in 48-well platen.

Meng in een buis van 1,5 milliliter het virus met 12 microliter van een magnetische nanodeeltjesoplossing en ontcubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na 15 minuten de magnetische nanodeeltjesoplossing en het virusmengsel toe aan de te transduceren cellen. Plaats de 48-well plaat op een magnetische plaat, en incubeer in een standaard weefsel cultuur incubator voor ten minste twee uur.

Wanneer de virale transfectie is voltooid, breng de geïnfecteerde organoïde cel clusters en transductie medium van elke put in een 1,5-milliliter buis. Centrifuge op 500 keer g gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant met zachte zuigkracht, en koel de buizen met de pellet op ijs gedurende vijf minuten.

Voeg 120 microliters van kelder membraan matrix aan elke buis, en resuspend de pellet door langzaam pipetter op en neer. Zaad 30-microliter druppels van het matrix-celmengsel in een nieuwe 48-put plaat. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius gedurende vijf tot 15 minuten totdat de matrix stolt.

Voeg transductie medium aan elke put, en incubeer in een standaard weefsel cultuur incubator voor drie tot vier dagen. Na drie tot vier dagen, inspecteer de culturen onder een lichtmicroscoop bij 10x vergroting om de organisatie van celclusters in organoïde structuren te verzekeren. Vervang het transductiemedium in elke put voorzichtig door 250 microliter organoïde cultuur ENR medium.

Breng de plaat terug naar de couveuse. Begin deze procedure door het VERWIJDEREN van de ENR medium door zachte zuigkracht, voorzichtig niet te verstoren de kelder membraan matrix. Was voorzichtig met 500 microliter PBS.

Bevestig de organoïden door een microliter van 4% paraformaldehydeoplossing per put toe te voegen en 30 minuten bij kamertemperatuur in te broeden. Verwijder na 30 minuten de paraformaldehydeoplossing door afzuiging. Voeg voorzichtig een microliter PBS per put toe en verwijder de PBS door zachte zuigkracht.

Op deze manier, was twee keer met PBS. Verwijder de PBS uit de tweede wasbeurt en voeg één microliter van 30% sacharosebuffer toe aan elk monster. Incubeer de vaste organoïden in sacharose gedurende een uur bij vier graden Celsius om de monsters te dehydrateren.

Verwijder de sacharose buffer door zuiging, en voeg net genoeg inbedding verbinding om de matrixlaag in elke put te dekken. Vijf minuten op kamertemperatuur uitbroeden. Plaats vervolgens de monsters in een min 80-graden Celsius vriezer gedurende 10 minuten of totdat de inbedding verbinding wordt solide en wit.

Plaats de plaat met bevroren inbedding verbinding op kamertemperatuur om voor een minimale smelten van de verbinding langs de randen. Gebruik een scalpel of spatel om het blok te scheiden van de muren van de put. Werk snel om smelten te voorkomen, met behulp van tangen om de matrix inbedding compound blok te verwijderen, en plaats het in een monster blok.

Vul de mal volledig met inbedding verbinding. Vries 30 minuten in bij min 80 graden Celsius voordat u het blok gebruikt voor het doorsnede. Dit protocol werd geoptimaliseerd door de eerste transducerende darmorganoïden met lentivirale vectoren gekoppeld aan GFP.

De GFP werd gevisualiseerd in elke fase in organoïde ontwikkeling, ook al vroeg wanneer cryptische cellen zich organiseren in cyste-achtige structuren of op latere momenten wanneer organoïden knoppen vormen. Met succes getransduceerde darmorganoïden werden vervolgens formeel gefixeerd, cryosectioned, en geanalyseerd door immunofluorescentie beeldvorming. In deze afbeelding worden kernen in blauw gekleurd en het groen geeft epitheliale celhechtingmoleculen aan, die celranden afbakenen.

De rode geeft lysosome vlekken aan om Paneth cellen te identificeren. Eenmaal onder de knie, transducerende organoïden kunnen worden uitgevoerd in ongeveer drie uur, en organoïden crysection inbedding kan worden gedaan in ongeveer 2 1/2 uur. Bij het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om te werken op ijs bij de behandeling van kelder matrix reagentia.

Na het voltooien van deze procedure kunnen immunofluorescente analyse en andere methoden om eiwitten of organellen te detecteren worden uitgevoerd om lokalisatie of relatieve overvloed te beoordelen. Deze techniek effent de manieren voor onderzoekers om normale biologie en ziektetoestanden in vitro te verkennen en ook voor in vivo studies als de getransduceerde organoïden of cellen in muizen kunnen worden geïmplanteerd. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe magnetisch gelabelde virussen te gebruiken om genetisch ingenieur organoïden voor cryosectioning.

Vergeet niet dat het werken met virussen zeer gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van de juiste beschermende kleding moet altijd worden uitgevoerd bij het uitvoeren van deze procedure.