Genetische manipulatie van primaire muis intestinale Organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes transductie virale vectoren voor bevroren snijden
10 mei 2019
We beschrijven stap-voor-stap instructies voor: 1) efficiënt ingenieur intestinale organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes voor Lenti-of retrovirale transductie, en, 2) het genereren van bevroren secties van engineered organoïden. Deze aanpak biedt een krachtig hulpmiddel om de genexpressie in organoïden efficiënt te veranderen voor onderzoek naar stroomafwaartse effecten.
Omdat organoïden de inheemse structurele organisatie samenvatten, evenals vele moleculaire kenmerken van darmeptheel in vivo, stelt deze techniek ons in staat om normale biologie en ziektetoestanden in het laboratorium te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het vermogen om organoïden genetisch te manipulatie met behulp van een zeer efficiënte transductiebenadering met lage cytotoxiciteit, waardoor functionele studies van deze genetisch gemanipuleerde organoïden mogelijk zijn. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot therapie voor darmziekten omdat we darmorganoïden kunnen blootstellen aan medicijnen en andere middelen of interventies.
Deze methode kan worden toegepast op het bestuderen van ontwikkelings- en pathologische processen in andere systemen die vatbaar zijn voor organoïde culturen, zoals borstweefsels of voor cellen die groeien onder standaard 2D-omstandigheden. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn bij deze methode slagen met transductie in moeilijk te ontwerpen organoïden of andere cellen. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we problemen ondervonden bij het transduceren van onze organoïden en stamcellen.
Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang als structureel verlies van de organoïden kan optreden als monsters niet goed worden behandeld tijdens het inbeddingsproces in de kelder matrix voor cryosectioning. Om organoïden te kweken voor virale transductie, zaad organoïde celculturen met 200 microliters van transductie medium per put in een 48-well plaat, en incubeer in een standaard weefsel cultuur incubator. Dooi flacons van virus voor transductie, waardoor ongeveer 50 microliter geconcentreerd virus voor de transductie van elke put in 48-well platen.
Meng in een buis van 1,5 milliliter het virus met 12 microliter van een magnetische nanodeeltjesoplossing en ontcubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na 15 minuten de magnetische nanodeeltjesoplossing en het virusmengsel toe aan de te transduceren cellen. Plaats de 48-well plaat op een magnetische plaat, en incubeer in een standaard weefsel cultuur incubator voor ten minste twee uur.
Wanneer de virale transfectie is voltooid, breng de geïnfecteerde organoïde cel clusters en transductie medium van elke put in een 1,5-milliliter buis. Centrifuge op 500 keer g gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant met zachte zuigkracht, en koel de buizen met de pellet op ijs gedurende vijf minuten.
Voeg 120 microliters van kelder membraan matrix aan elke buis, en resuspend de pellet door langzaam pipetter op en neer. Zaad 30-microliter druppels van het matrix-celmengsel in een nieuwe 48-put plaat. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius gedurende vijf tot 15 minuten totdat de matrix stolt.
Voeg transductie medium aan elke put, en incubeer in een standaard weefsel cultuur incubator voor drie tot vier dagen. Na drie tot vier dagen, inspecteer de culturen onder een lichtmicroscoop bij 10x vergroting om de organisatie van celclusters in organoïde structuren te verzekeren. Vervang het transductiemedium in elke put voorzichtig door 250 microliter organoïde cultuur ENR medium.
Breng de plaat terug naar de couveuse. Begin deze procedure door het VERWIJDEREN van de ENR medium door zachte zuigkracht, voorzichtig niet te verstoren de kelder membraan matrix. Was voorzichtig met 500 microliter PBS.
Bevestig de organoïden door een microliter van 4% paraformaldehydeoplossing per put toe te voegen en 30 minuten bij kamertemperatuur in te broeden. Verwijder na 30 minuten de paraformaldehydeoplossing door afzuiging. Voeg voorzichtig een microliter PBS per put toe en verwijder de PBS door zachte zuigkracht.
Op deze manier, was twee keer met PBS. Verwijder de PBS uit de tweede wasbeurt en voeg één microliter van 30% sacharosebuffer toe aan elk monster. Incubeer de vaste organoïden in sacharose gedurende een uur bij vier graden Celsius om de monsters te dehydrateren.
Verwijder de sacharose buffer door zuiging, en voeg net genoeg inbedding verbinding om de matrixlaag in elke put te dekken. Vijf minuten op kamertemperatuur uitbroeden. Plaats vervolgens de monsters in een min 80-graden Celsius vriezer gedurende 10 minuten of totdat de inbedding verbinding wordt solide en wit.
Plaats de plaat met bevroren inbedding verbinding op kamertemperatuur om voor een minimale smelten van de verbinding langs de randen. Gebruik een scalpel of spatel om het blok te scheiden van de muren van de put. Werk snel om smelten te voorkomen, met behulp van tangen om de matrix inbedding compound blok te verwijderen, en plaats het in een monster blok.
Vul de mal volledig met inbedding verbinding. Vries 30 minuten in bij min 80 graden Celsius voordat u het blok gebruikt voor het doorsnede. Dit protocol werd geoptimaliseerd door de eerste transducerende darmorganoïden met lentivirale vectoren gekoppeld aan GFP.
De GFP werd gevisualiseerd in elke fase in organoïde ontwikkeling, ook al vroeg wanneer cryptische cellen zich organiseren in cyste-achtige structuren of op latere momenten wanneer organoïden knoppen vormen. Met succes getransduceerde darmorganoïden werden vervolgens formeel gefixeerd, cryosectioned, en geanalyseerd door immunofluorescentie beeldvorming. In deze afbeelding worden kernen in blauw gekleurd en het groen geeft epitheliale celhechtingmoleculen aan, die celranden afbakenen.
De rode geeft lysosome vlekken aan om Paneth cellen te identificeren. Eenmaal onder de knie, transducerende organoïden kunnen worden uitgevoerd in ongeveer drie uur, en organoïden crysection inbedding kan worden gedaan in ongeveer 2 1/2 uur. Bij het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om te werken op ijs bij de behandeling van kelder matrix reagentia.
Na het voltooien van deze procedure kunnen immunofluorescente analyse en andere methoden om eiwitten of organellen te detecteren worden uitgevoerd om lokalisatie of relatieve overvloed te beoordelen. Deze techniek effent de manieren voor onderzoekers om normale biologie en ziektetoestanden in vitro te verkennen en ook voor in vivo studies als de getransduceerde organoïden of cellen in muizen kunnen worden geïmplanteerd. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe magnetisch gelabelde virussen te gebruiken om genetisch ingenieur organoïden voor cryosectioning.
Vergeet niet dat het werken met virussen zeer gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van de juiste beschermende kleding moet altijd worden uitgevoerd bij het uitvoeren van deze procedure.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het modificeren van intestinale organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes voor een efficiënte gentransductie. Daarnaast wordt gedetailleerd beschreven hoe er cryosneden van deze gemodificeerde organoïden kunnen worden gemaakt, wat de studie naar genexpressie en de daaropvolgende effecten vergemakkelijkt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Organoïdtechnologie
Achtergrond
- Organoïden bootsen de structurele en moleculaire kenmerken van het darmepitheel in vivo na.
- Deze techniek maakt het mogelijk om normale biologische processen en ziektebeelden te bestuderen.
- Genetische modificatie van organoïden kan worden uitgevoerd met een lage cytotoxiciteit.
- Toepassingen strekken zich uit tot blootstelling aan geneesmiddelen en interventies voor darmziekten.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te bieden voor de transductie van organoïden.
- Om functionele studies van genetisch gemanipuleerde organoïden mogelijk te maken.
- Om de studie van ontwikkelings- en pathologische processen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Het engineeren van intestinale organoïden met magnetische nanodeeltjes.
- Lenti- of retrovirale transductie voor het wijzigen van genexpressie.
- Het maken van cryosecties van geengineerde organoïden.
- Functionele studies met genetisch gemodificeerde organoïden.
Belangrijkste resultaten
- Aantoonbare hoge efficiëntie bij de transductie van organoïden die moeilijk te modificeren zijn.
- Lage cytotoxiciteit aangetoond in verband met de transductiemethode.
- Inzicht geboden in de effecten van genetische modificaties op de functie van organoïden.
- Potentiële therapeutische toepassingen voor darmziekten belicht.
Conclusies
- De methode biedt een krachtig instrument voor genexpressiestudies in organoïden.
- Het kan worden toegepast op diverse organoïdenkweken buiten darmweefsels.
- Toekomstig onderzoek kan deze techniek benutten voor therapeutische interventies.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Efficiënte genetische modificatie van intestinale organoïden maakt een snelle functionele beoordeling van genetische targets mogelijk in een fysiologisch relevant systeem, waardoor de afhankelijkheid van kostbare en tijdrovende CRISPR-workflows wordt verminderd. Deze aanpak ondersteunt vroege targetvalidatie en mechanistische risicovermindering door genetische modulatie te koppelen aan fenotypische readouts in ziekterelevante epitheliale structuren. De methode verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid in preklinische modellen door de natuurlijke weefselarchitectuur te behouden, terwijl schaalbare en reproduceerbare transductie mogelijk wordt gemaakt voor downstream studies naar medicijnrespons.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt snelle toetsing van therapeutische hypothesen mogelijk door middel van efficiënte virale transductie van intestinale organoïden met minimale cytotoxiciteit.
- Operationele waarde: Vermindert de tijd en kosten die verbonden zijn aan CRISPR/Cas9-selectie en -screening, waardoor tijdlijnen voor targetvalidatie worden versneld.
- Strategische waarde: Ondersteunt de functionele beoordeling van genexpressie of gene silencing in stamcel- en cryptcompartimenten, wat de betrouwbaarheid van het target verbetert.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert transductie-competente organoïden die geschikt zijn voor immunohistochemische of immunofluorescente analyse van veranderingen in genexpressie.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerde workflow voor vriescoupes die de weefselmorfologie behoudt voor downstream studies naar eiwitlokalisatie.
- Strategische waarde: Maakt betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk door blootstellingsstudies met geneesmiddelen in genetisch gemodificeerde organoïden die de in vivo epitheliale organisatie nabootsen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de beoordeling van de functie van intestinale stamcellen en crypten na genetische manipulatie, wat functionele read-outs ondersteunt die relevant zijn voor ziektebeelden.
- Operationele waarde: Maakt het mogelijk om getransduceerde organoïden in muizen te implanteren voor in vivo functionele analyse, waardoor in vitro bevindingen worden gekoppeld aan fysiologische validatie.
- Strategische waarde: Ondersteunt de voorspelling van therapeutische responsen door drug-effecten op genexpressie of proteïnefunctie te modelleren in plaats van genomische alteraties.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in vroege discovery-workflows door snelle genmodulatie in organoïden mogelijk te maken, wat de overgang van doelhypothese naar functionele validatie ondersteunt voorafgaand aan de identificatie van lead-verbindingen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten en het verduidelijken van signaalpaden door middel van efficiënte transductie van intestinale organoïden voor studies naar genexpressie of gene silencing.
- Screening: Levert assay-klare, genetisch gemodificeerde organoïden met behoud van morfologie voor kwantitatieve beeldvorming en functionele read-outs.
- Analytica: Maakt immunofluorescentie-gebaseerde kwantificering van epitheliale adhesiemoleculen, lysosomale markers en nucleaire kleuring mogelijk om de transductie-efficiëntie en cellulaire fenotypen te beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro organoïden-engineering met in vivo studies via implantatie van getransduceerde organoïden in muizen voor functionele analyse.
- Bedrijfmatige hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor genetische manipulatie van intestinale en andere epitheliale organoïden over meerdere targets en screeningscampagnes voor geneesmiddelen.
Operationele impact & impact op de onderneming
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door genetische modificaties te koppelen aan functionele resultaten in een ziekterelevant epitheliaal systeem.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via transductie ondersteund door magnetische nanodeeltjes en gestandaardiseerde cryosectie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie te verminderen door middel van snelle fenotypische beoordeling.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van functionele organoïdrespons op genetische en farmacologische perturbaties.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in organoïdecultuur, de omgang met virussen en de preparatie van magnetische nanodeeltjes.
- Vereist toegang tot magnetische platen, cryostaatapparatuur en infrastructuur voor immunofluorescentie-beeldvorming.
- Vraagt om gestandaardiseerde training om structureel verlies tijdens de inbeddings- en coupesnedestappen te voorkomen.
- Vereist optimalisatie voor verschillende organoïdetypen en virale serotypes voor een consistente transductie-efficiëntie.
- Omvat bioveiligheidsmaatregelen vanwege het gebruik van virale vectoren, inclusief PBM en containmentprotocollen.
