Extra Cellular Matrix-based en extra cellular matrix-vrije generatie van Murine Testiculaire Organoïden

Deze protocollen stellen de gebruiker in staat om een groot aantal structureel mimetische en endocriene functionele testiculaire organoïden te produceren in zowel ECM- als DCM-vrije omgevingen in 2D- of 3D-kweekomstandigheden. Deze technieken zijn zeer reproduceerbaar, gemakkelijk toegepast op standaard biologische laboratoriuminstellingen, en alleen gebruik maken van gemeenschappelijke instrumenten en materialen. Testiculaire organoïden zijn een nieuw hulpmiddel voor het simuleren van spermatogenese en reproductieve endocrinologie in vitro, en zou op een dag de studie van in vitro gametogenese mogelijk kunnen maken.

Begin met het plaatsen van de geëuthanaseerde muis supine op een dissectie mat en steriliseren van de buik met 70%ethanol. Tent de huid van de onderbuik met tangen en open het met een schaar. Zoek de teelballen in de linker- en rechtergebieden van de buik en snijd hun verbindingen met de vas deferens en eventuele verankering bindweefsel.

Til vervolgens de hele teelballen van het dier. Plaats het in een petrischaaltje van vooraf geëquilibreerde BM. Maak onder een dissectiemicroscoop een kleine incisie in de tunica albuginea aan één uiteinde van elke testis met een kleine microdissectieschaar of door zachtjes te scheuren met twee fijne tangen. Terwijl u de testis van het tegenovergestelde uiteinde van de incisie houdt, knijpt u deze voorzichtig met fijne tangen en duw u in een vegende beweging naar het gat in de tunica, waardoor het testiculaire weefsel als één samenhangend stuk wordt losgegeven.

Snijd het weefsel in kleinere stukken. Leg de stukken in een milliliter prewarme dissociatieoplossing een en incubeer ze op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Na de incubatie, voorzichtig trituraat de teelballen stukken 50 keer met een P1000 pipet.

Zorg ervoor dat de tubuli van elkaar en van het interstitiële weefsel scheiden. Als klonten blijven, incubeer voor een extra vijf minuten en trituraat weer. Voeg 33 microliter hyaluronidase voorraadoplossing per één milliliter van het dissociatiemengsel toe.

Dan tritureren 50 keer met een P1000 pipet en incubeer het monster op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Na de incubatie, trituraat het 50 keer met een P200 pipet. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat er geen zichtbare tubuli of klonten cellen aanwezig zijn, doven de dissociatieenzymen door FBS toe te voegen aan 10% van het totale volume van het monster en trituraat het meerdere malen met een P200 pipet.

Nat het centrum van een 40 micrometer cel zeef met media en aspirate het weg, voeg dan het monster aan de voorbesteed zeef en filter het om een eencellige suspensie te produceren. Centrifuge de vering op 100 keer g gedurende zeven minuten. Gooi de supernatant weg en plaats de cellen opnieuw in verse BM. Tel de levensvatbare cellen op een hemocytometer met behulp van trypan blauwe uitsluiting, dan re-centrifuge en resuspend ze in verse BM. Voor 2D ECM-vrije cultuur, plaat eencellige suspensies direct op vier-put kamer dia's en plaats de dia's in een 35 graden Celsius incubator.

Voor 2D ECM-cultuur, afzien van 100 microliters van koude een-op-een verdund extracellulaire matrix medium in een vier-put kamer dia, ervoor te zorgen dat de gel de schotel bodem bedekt. Plaats de glijbaan minimaal 30 minuten in de couveuse om de ECM in een gel te laten polymeriseren en voeg er vervolgens de celsuspensie aan toe. Voor een 3D ECM-vrije cultuur, plaats agarose 3D Petri gerechten in een 24-well cultuur schotel en bedek ze met een milliliter BM. Laat de gerechten minstens 30 minuten in BM equiliberen in een 35 graden Celsius incubator, gooi de BM weg en herhaal het evenwicht nogmaals met één milliliter verse BM. Verwijder alle BM uit de put en afzien van 200 microliter verse BM rond, maar niet in het midden uitsparing van de 3D Petri schotel, dan verzamelen van de resterende BM uit het centrum cel zaaien uitsparing van de micro goed insert.

Doe de eencellige suspensie in de middenuitsparing en triturate zachtjes op en neer. Plaats het gerecht in een bevochtigde 35 graden Celsius incubator voor cultuur. Op de volgende dag, langzaam en zorgvuldig te verwijderen bestaande media uit rond de agarose 3D Petri schotel en vervangen door een milliliter verse BM. De organoïden moeten 's nachts verdicht hebben, zodat ze aan de onderkant kunnen rusten.

Voor de 3D ECM-cultuur moet u een eencellige suspensie voorbereiden door gelijke delen van de celsuspensie in BM te combineren met koude voor ontdooide ECM. Trituraat meerdere malen om ervoor te zorgen dat het goed gemengd. Dan onmiddellijk afzien van het mengsel in een vier-put kamer schuif, ervoor te zorgen dat het de hele bodem van de plaat bedekt.

Broed de kamer dia's op 35 graden Celsius en laat de inhoud ervan te polymeriseren voor ten minste 30 minuten. Voeg na de polymerisatie 500 microliter BM toe bovenop de cultuur. Cultuur alle organoïde modeltypes op 35 graden Celsius.

Voor alle cultuurtypes wisselt u de helft van hun media uit met verse BM om de twee dagen. Dit protocol werd gebruikt om organoïde generatie te bereiken binnen 24 uur met behulp van jonge murine testiculaire cellen. Met succes gegenereerde weefsels werden in eerste instantie waargenomen als 3D-celclusters.

In ECM-omgevingen beschikten de celclusters duidelijke marges tussen het cluster en hun omgeving. Celclusters werden ook waargenomen om over de ECM te migreren en samen te smelten. De 3D ECM cultuur vergde aanzienlijk meer tijd om de novo structuren te assembleren dan alle andere cultuurmethoden.

En de 3D ECM-vrije cultuur produceerde de grootste clusters met een enkele grote en compacte cluster binnen elke put van de 3D agarose Petri schotel. Om te beoordelen of de organoïde modellen lijken op het inheemse weefsel, werden de biologische constructies gesondeerd op celspecifieke markers en gevisualiseerd met immunofluorescentie. De 2D ECM en 3D ECM-vrije methoden geproduceerd organoïden met een innerlijke morfologie zeer mimetisch van testiculaire compartimentering.

Een langetermijnanalyse werd uitgevoerd op de 3D ECM-vrije geassembleerde organoïden. De organoïden werden 14 dagen gekweekt en vervolgens onderzocht op cel- en structuurspecifieke markers. Tubule-achtige structuren werden waargenomen.

De 3D ECM-vrije organoïden werden ook bestudeerd voor endocriene functie in een 12-weekse cultuur met gonadotropine stimulatie. Testosteron en inhibine B werden beide gekwantificeerd van organoïde geconditioneerd medium. Na 12 weken werden gonadotropinen gedurende 48 uur verwijderd, waardoor testosteron en inhibine B-concentraties daalden.

Toen de gonadotropinen werden teruggestuurd, beide hormoonconcentraties aanzienlijk toegenomen, waaruit blijkt een goede endocriene responsiviteit. Organoïde assemblage maakt gebruik van het autonome gedrag van levensvatbare onrijpe testiculaire cellen. Creatieve experimenten kunnen gemakkelijk worden bedacht door het gebruik van aangepaste cel gesorteerd of hybride cel mengsels.

Na celzaaien kan live video imaging of time-lapse imaging worden gebruikt om organoïde zelfassemblage te kwantificeren. Over cultuur heen kunnen organoïden en conditiemedium worden verzameld voor histologische en aminotestanalyses.