Kwantificeren van de Brain Gemetastatische Tumor Micro-Environment met behulp van een Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning en Confocal Tomography

Confocale tomografie werd ontwikkeld om het volledige gamma van kankercelgedrag te verkrijgen, omdat ze interageren met de cellulaire barrière en niche. Deze methode biedt een basis voor het bestuderen van uitzaaiingen als ze zich voordoen. Deze aanpak is handig voor het kwantificeren van levend celgedrag.

Confocale tomografie, in combinatie met machine learning, is nuttig voor een verscheidenheid van organ-on-a-chip platforms. Het analyseren van primaire of terugkerende tumor of circulerende tumorcellen kan een belangrijk diagnostisch hulpmiddel zijn om hersenmetastasen te voorspellen en hersenstaase te onderscheiden van niet-hersenstastatische cellen. Om het microfluidic BBN-apparaat te monteren, breng je een apparaat van de vacuümdesiccator over op een geschikt oppervlak met de inhammen naar beneden gericht en plaats je de hele opstelling in een plasmakamer.

Plaats de hele setup in een plasmakamer en trek een vacuüm voordat u het apparaat gedurende 30 seconden met plasma op 80 Watt behandelt. Gebruik aan het einde van de behandeling een handleiding om het apparaat snel te plaatsen, de zijkant op de glazen schuif op de labbank in te nemen om een permanente band te creëren tussen de PDM's van het apparaat en de dia. Steek vervolgens 200 microliter pipettips in, snijd twee millimeter van de punt in alle inhammen en uitlaten en plaats het apparaat in de plasmakamer voor een plasmakamer van acht minuten en 200 watt plasmabehandeling.

Nadat het apparaat is afgekoeld, plaatst u het apparaat in een steriele secundaire houder en breng binnen 15 minuten na de behandeling van plasmide 120 microliters van een collageen astrocytenoplossing in het apparaat via de pipetpunt voor de onderste kamer. Laat de oplossing over de kamer in de tegenoverliggende pipetpunt lopen en vul het volgende kanaal van het apparaat. Wanneer alle vier de kanalen van het apparaat zijn gevuld, plaats de chip in de celcultuur incubator voor een uur.

Wanneer het collageen is ingesteld, smeer dan alle pipettetips die de onderste kamer voeden met het juiste volledige celcultuurmedium en bestrijk de bovenste kamer met 2%-groeifactor verminderde matrigel, in volledig endotheel medium. Wanneer beide kamers zijn gecodeerd, plaatst u het apparaat een uur in de couveuse voordat u de bovenste kamer met het juiste medium spoelt. Afwisselende tips, zie 30 microliters van een keer 10 tot de zesde endotheelcellen per milliliter van het juiste medium, via de tips in de bovenste kamer om de 15 minuten, voor een totaal van vier aliquots van cellen per tip.

Incuberen het apparaat tussen zaailingen. Wanneer alle endotheelcellen zijn gezaaid, vul alle tips met het medium en breng het apparaat 48 uur terug naar de celkweek incubator. Wanneer de endotheellaag is gerijpt, vervangt u het medium in de chip om het medium celkweek aan te vullen en elk bovenste kamerkanaal te zaaien met 30 microliters van één keer 10 tot de zes kankercellen per milliliter van het juiste medium.

Nadat elke 30 microliter aliquot van cellen is gezaaid, breng het apparaat terug naar de incubator gedurende 15 minuten en vul het vervolgens alle tips met het juiste medium om het apparaat 24 tot 48 uur terug te brengen naar de celkweek incubator. Nadat het apparaat is gekweekt en afgebeeld, om het fenotype van de kankercellen te meten, open de meegeleverde software en lees het confocale beeld in het geheugen. De software slaat elk kleurkanaal van de 3D confocale afbeelding op in een apart TIFF-bestand.

Selecteer Dekkingswaarden wijzigen voor elk microscoopkanaal'en pas de kanaalalcingwaarde aan voor de kleurkanalen die in de afbeelding aanwezig zijn, zodat de achtergrond wordt verwijderd en alleen de fluorescerende waarden in de cellen overblijven. Als u het effect wilt visualiseren, selecteert u Een 3D-rendering weergeven om te controleren of de drempelwaarde correct is ingesteld en als de afbeelding er correct uitziet, de dekkingswaarden opslaat in de spreadsheet van de experimenttracker. Gebruik vervolgens marcherende kubussen om de volumeafbeelding om te zetten in afzonderlijke 3D-driehoekige meshed-objecten die zijn opgeslagen in de VTK-gegevensindeling.

Om een vliegtuig aan de endotheelbarrière te plaatsen, zoek eerst de celcentroids. Gebruik het polydata-connectiviteitsfilter om de lijst met mazen in het VTK-bestand te herhalen om de regio's te extraheren die niet zijn verbonden. Bereken de centroid van elk gaas en voeg de meting toe aan een lijst met centroids die filteren op te grote of te kleine mazen.

Om een vlak aan de lijst van centroids voor de endotheelcellen te passen, gebruikt u een minimalisering van de foutmethode, visualiseer RFP-centroids en vlakfit'om de pasvorm van het vlak te genereren en uit te plotten en de pasvorm van het vlak te inspecteren, waarbij de pasvorm zo nodig handmatig wordt aangepast. Wanneer het vliegtuig goed is gemonteerd, slaat u het normale van het vliegtuig op in het experimenttrackerbestand. Om elk fenotype van kankercellen te meten nadat u de endotheellaag met een vlak hebt gekenmerkt, laadt u de celanalysefunctie en voert u Lees in de informatie over de experimenttracker en analyseert u de kanalen die bestaan om elke regio in het VTK-bestand te herhalen en te analyseren.

Voor elke regio wordt elke cel in de functie geclips, zodat het gaas onder het membraan wordt berekend. Om het cellulaire fenotype te meten, berekent u de vorm, het volume en de positie van elke kankercel. Meet vervolgens het volume en de positie van elke afgeknipte kankercel om het percentage cel te berekenen dat door de endotheelbarrière is extravasated.

Nadat deze stappen voor verschillende experimenten zijn uitgevoerd, worden de gegevens als één xlsx-bestand geëxporteerd om de gegevens in een spreadsheet op te slaan. Een microfluïde BBN-chip met een confluent endotheelbarrière is acceptabel voor experimenten, terwijl een microfluïde BBN-chip met bijzonder slechte endotheeldekking dat niet is. In deze representatieve analyse de hersenen op zoek naar kankercellijn, vertoont een subpopulatie van cellen die extravasates over de endotheelbarrière en migreert diep in de hersenen niche ruimte van de microfluïde BBN chip Op twee en negen dagen na blootstelling, de ouderlijke kankercellen onderhouden een aanzienlijk deel van de cellen op de top van de barrière uit de buurt van de hersenen niche ruimte , terwijl de hersenen gemetastaseerde kankercelpopulatie onderhouden een deel van de cellen die groter waren dan 100%extravasated.

Morfologische kwantificering van de vorm van kankercellen gaf aan dat ouderlijke cellen op dag één minder bolvormig gevormde cellen vertoonden, terwijl na twee en negen dagen interactie beide kankercellijnen trendeerden naar het verminderen van hun sfericiteit. Bovendien waren de subpopulaties van kankercellen die in de astricydische niche extravaseerden kleiner in omvang, vergeleken met de kankercellen die in interactie met de endotheelbarrière bleven zonder extravaserend in de hersenen. Hersenen op zoek naar kanker cellijnen en patiënt afgeleide xenografts, vertonen een fenotypische patroon in de microfluïde BBN-chip die kan worden benut om onderscheid te maken tussen de hersenen gemetastaseerde en niet-hersenuitzaaiende kankercellen door machine learning.

Zelfselectie is belangrijk. Endotheelcellen met een hoger, laag passageaantal vertoonden variabel barrièregedrag. Bovendien kunnen kankercellen en hun fluorescerende expressie in de loop van de tijd veranderen.

Na deze procedure kunnen onderzoekers moleculaire profilering van het huis of de cellen van het geheim in het apparaat gebruiken om moleculaire mechanismen van metastasen te bestuderen. Deze techniek maakt het mogelijk om complexe interacties tussen kankercellen en hun micro-omgevingen te verkennen, door een ontworpen micro-omgeving te combineren met een kwantitatieve beeldvorming van nichecomponenten in de loop van de tijd.