Isoleren en beeldvorming Live, intact pacemakergebieden van het nierbekken van de muis door vibratoomsecties

Dit protocol levert intacte pacemakergebieden van het nierbekken op, het gladde spierorgaan in de nier dat urine in de urine baarmoeder en in de blaas pompt. In tegenstelling tot het isoleren van cellen van het nierbekken, biedt deze aanpak intacte in situ omgevingen van pacemakergebieden van het nierbekken en een meer fysiologische voorbereiding voor het bestuderen van het tempo van het nierbekken. Een persoon die deze techniek nog nooit heeft uitgevoerd, kan moeite hebben om uniforme secties te snijden.

Een nieuwe gebruiker moet ervoor zorgen dat de nier waterpas staat in het vibratoomstadium en het snijproces niet versnelt. Knijp met behulp van interne weefseldop en interne dissectieschaar de darmen en til ze weg van de buikwand. Snijd tegelijkertijd de onderkant van de darmen vrij van het lichaam bij de proximale twaalfvingerige darm en distale dikke darm om toegang te krijgen tot de retroperitoneale ruimte die de nieren bevat.

Knijp voorzichtig en til het distale uiteinde van de ureter op met een weefseldop. Snijd met behulp van de dissectieschaar onder de beknelde urine naar de nier totdat deze is bevrijd van het omliggende bindweefsel. Zodra de nieren zijn blootgesteld, extraheer ze afzonderlijk.

Vul een met silicium elastomeer beklede schaal met ijskoude KRB-oplossing. Breng de nier over naar de dissectieschaal en zorg ervoor dat deze volledig onder water staat. Gebruik een fijne veerschaar en interne tang om vetweefsel uit de basis van de nier te verwijderen om het distale nierbekken, of RP, en proximale urine baarmoeder bloot te leggen.

Verwijder de proximale ureter en een deel van de distale RP van de basis met behulp van een fijne veerschaar en tang. Doorboor de buitenste niercapsule met een fijne tip forceps, hengel de uiteinden weg van het nierlichaam. Knijp met elke hand met een tang de losse uiteinden van de capsule en pel ze uit elkaar totdat het resterende niercapsulemembraan volledig is verwijderd.

Steek een scheermesje in de meshouder van het vibratome-instrument en stel de spelingshoek van het mes in op ongeveer 18 graden. Pas de bladparameters aan zoals vermeld in het teksthandschrift, zodat de dikte van de niersectie niet groter is dan 150 micrometer, wat een negatieve invloed zou hebben op calciumion imaging-experimenten. Gebruik een stompe tang om de voorbereide nier voorzichtig vast te pakken en te verwijderen uit de ijskoude KRB-oplossing.

Plaats de nier onmiddellijk ongeveer twee tot vier seconden op absorberend papier om overtollig extern vocht te verwijderen. Rol de nier voorzichtig over het absorberende papier om ervoor te zorgen dat alle zijden van het parenchym zijn opgedroogd, zodat er een optimale hechting van de nier aan het vibratoomstadium is. Breng onmiddellijk een dunne laag cyanoacrylaatlijm aan op de basis van de vibratoommonsterplaat en gebruik een stompe tang om de nier ureterzijde naar beneden te plaatsen op het gebied bedekt met lijm.

Oefen voorzichtig neerwaartse druk uit op de bovenkant van de nier met de platte rand van de tang gedurende ongeveer 10 tot 20 seconden om de lijm te drogen. Bevestig de monsterplaat stevig aan de onderkant van de bufferlade en pas het krb-gehalte aan zodat de bovenkant van de nier volledig is ondergedompeld. Voor automatische vibratoomdoorsneden selecteert u de begin- en eindposities van de trilbladsnijcyclus op 0,5 tot 1 centimeter van de nier om ervoor te zorgen dat het hele niervlak wordt doorsneden.

Start het automatische snijproces en zorg ervoor dat het mes contact maakt met de nier. Verzamel met behulp van een tang secties die uit de nier zijn bevrijd en breng ze onmiddellijk over naar individuele putten. Ga verder met het doorsnedeprotocol en gebruik een lichtmicroscoop om PKJ-regio's in de nierschijfjes te identificeren totdat de PKJ-regio's duidelijker worden.

Vul een met silicium elastomeer bedekte beeldvormingsschaal met ijskoude KRB-oplossing. Breng een individuele nierschijf over op de schaal. Plaats Minutien-pinnen rond de rand van een nierschijf om de sectie aan de basis van de beeldvormingsschaal te beveiligen.

Plaats de beeldvormingsschaal op het podium van een rechtopstaande confocale microscoop van de spinschijf en begin onmiddellijk met perfusing met KRB-oplossing. Gebruik een lage vergroting water onderdompeling objectieve lens om de nier plak te lokaliseren. Centreer het beeldvormingsveld op gebieden van het segment waar de PKJ aanwezig is met behulp van oriëntatiepunten.

Zodra de PKJ zich bevindt, gebruikt u een hogere vergroting wateronderdompeling objectieve lens om het gebied van belang te vergroten. Onderscheid verschillende cellen van belang in verschillende soorten calciumionen transiënte duur in de PKJ-wand. Zodra cellen van belang zijn geïdentificeerd, past u de laserintensiteit aan om een goede signaal-ruisverhouding op te leveren en registreert u beelden met een tijdelijke bemonsteringsfrequentie tussen 16 en 32 Hertz.

Lichte microscopische beelden van hele niersecties tonen geannoteerde oriëntatiepunten van een enkel PKJ-gebied. Meerdere PKJ-regio's aanwezig dicht bij de binnenste medulla en de distale nier. De locaties van de PKJ nierslagaders en PKJ grenzen worden hier getoond.

Een PKJ-sectie van een muis die GCaMP uitdrukt in PDGFR-alfapositieve cellen wordt hier weergegeven. De dunne PKJ-wand die tussen parenchymweefsel hangt, kan worden onderscheiden met behulp van oriëntatiepunten zoals de renale arteriole. De expressie van GCaMP6f in dit specifieke transgene weefsel is verspreid over de gehele breedte van de PKJ over zowel de spier- als adventitale lagen.

In de PDGFR alpha GCaMP6f positieve nierschijfjes is een netwerk van cellen dat zich doorgaans uitstrekt over de breedte van de PKJ-wand fluorescerend en vertoont het oscillerende calciumiontransiënten van verschillende duur en frequenties. In SMC GCaMP3 positieve nierschijfjes is een laag GCaMP3 positieve cellen aanwezig in de spierlaag. Een spatiotemporale kaart laat zien dat PDGFR alfa-positieve cellen in de PKJ adventitia lange duur laagfrequente calciumion transients opwekken, terwijl SMCs vaker calciumion transients met een kortere duur afvuurden.

Evenzo werd ook een reeks fluorescerende calciumionsignalen in en rond verzamelkanalen en oscillerende calciumion transients in de SMCs waargenomen. Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk dat de nier tijdens het doorsnijden van het vibratoom zo vlak mogelijk is om ervoor te zorgen dat uniforme nierschijfjes uit het blok worden bevrijd. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals eencellige isolatie, immunohistochie en moleculaire studies worden uitgevoerd om ons begrip van pacemakermechanismen in het nierbekken te vergroten.