ROS Live Cell Imaging tijdens neuronale ontwikkeling

Ons protocol beschrijft het gebruik van een waterstofperoxide biosensor in gekweekte zebravisneuronen en larven. Dit protocol zal onderzoekers helpen om de rol van reactieve zuurstofsoorten in de normale fysiologie en pathofysiologie te ontleden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de realtime detectie van waterstofperoxide in levende dieren en gekweekte cellen.

Deze methode kan worden toegepast op andere dieren, zoals het knaagdiermodelsysteem. Gebruik voor het bereiden van de afdeklips zuur gereinigde afdeklips die zijn opgeslagen in 100% ethanol. Gebruik een tang om één afdeklip uit de opslagcontainer te verwijderen en vlam deze om resterende ethanol te verwijderen.

Droog de hoezen volledig aan de lucht door deze schuin in een kweekschaal van 35 millimeter te plaatsen. Bereid Poly-D-Lysine of PDL, of werkoplossing. Breng PDL aan op het midden van elke afdeklip, vermijd verspreiding van de oplossing naar de randen en incubeer de PDL gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur.

Zorg ervoor dat de PDL niet uitdroogt. Was de PDL met 0,5 milliliter steriel water en laat de platen volledig drogen. Bereid lagmijn werkoplossing voor.

En breng het aan op het midden van elke coverslip, zorg ervoor dat de verspreiding van de oplossing naar de randen wordt vermeden. Incubeer de platen op 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator gedurende twee tot zes uur, vermijd het drogen van de laminineoplossing. Om een embryodissectie uit te voeren in netvliesganglioncellen of RGC's, bereidt en labelt u vier 35 millimeter weefselkweekgerechten en vult u deze met vier milliliter 70% ethanol.

E2 media één. E2 media twee. En E2 media drie, op de dag van ontleding.

Bewaar de borden in de koelkast. Wanneer zebravisembryo's 34 uur na de bevruchting zijn, haal dan de kweekschotels bedekt met lag uit de incubator. En was de afdekstrips drie keer met 0,5 milliliter 1X PBS.

Voeg na de laatste wasbeurt vier milliliter ZFCM+media toe aan elke kweekschotel. Vermijd het drogen van de plaat. Haal de bereide gekoelde kweekgerechten op en laat ze op kamertemperatuur komen.

Vul vier tot zes PCR-buizen met 15 microliters ZFCM+media. Haal zebravisembryo's uit de incubator en dompel embryo's onder in een 35 millimeter weefselkweekschaal met 70% ethanol gedurende 5-10 seconden om het te steriliseren. Breng embryo's met behulp van een pipet over naar de E2 media één schaal, die steriele E2-media bevat om overtollige ethanol af te wassen.

Breng vervolgens de embryo's over naar de E2 media twee schotel en verwijder hun koraal met scherpe tang. Breng ten slotte embryo's over naar de E2-media drie schotel om dissecties uit te voeren. Gebruik een paar fijne tangen en plaats embryo's voor of achter de dooier met een van de tangen.

En verwijder de staartposter naar de dooierzak met de andere tang. Pak de nek met een tang en doe het hoofd eraf om de hersenen en ogen bloot te stellen aan de E2-media. Rol met de punt van de fijne tang voorzichtig de ogen van het hoofd terwijl u het schedelweefsel met een tweede tang naar beneden houdt.

Breng vier ogen over naar een van de eerder voorbereide buizen met ZFCM + Triturate voorzichtig op en neer met een p20 pipet ongeveer 45 keer om cellen te dissocieren. Breng de ZFCM+ met de gedissocieerde cellen over naar het midden van de coverslips. Houd culturen op de banktop op 22 graden Celsius op een polystyreenschuimrek om trillingen te absorberen.

Controleer op de dag van beeldvorming cellen onder de microscoop om de groei van RGC-axonen te valideren. Voor live celbeeldvorming, breng de coverslips van de kweekschaal naar een live cel beeldvormingskamer. Gebruik een omgekeerde microscoop uitgerust met een DIC objectief OG-590 Longpass rood filter en een EMCCD camera.

Vervang vóór beeldvorming het ZFCM+medium door ZFCM-Na het positioneren van de cellen met de 10X-doelstelling, verkrijgt u beelden bij 60X-vergroting met behulp van een olie-onderdompelingsdoelstelling. Gebruik een extra vergroting van 1,5x. Koop eerst DIC-afbeeldingen.

Afbeelding roGFP2-Orp1, met behulp van de juiste filterset. Na het maken van de eerste set afbeeldingen, wissel je media uit met media met verschillende behandelingsoplossingen. Media moeten elke 30 minuten van beeldvorming worden gewijzigd om pH- en osmolariteitsveranderingen te voorkomen.

Voor in vivo beeldvorming, houd 22 tot 24-uurs embryo's na de bevruchting in E3-media, die 0,003% fenylthiothourea bevatten zonder methyleenblauw. Wissel media uit en verwijder dagelijks dode embryo's. Op de gewenste leeftijd, verdoven en mount embryo's in 1% agarose op 35 millimeter glazen bodem kweek gerechten.

Embryo's kunnen dorsaal, ventrally of lateraal worden georiënteerd, afhankelijk van de regio die van belang is voor beeldvorming. Nadat de agarose stolt, vul de gerechten met E3-media zonder methyleenblauw, maar met 0,016%tricaine. Zet de microscoop klaar voor beeldvorming.

Gebruik een omgekeerde laserscan confocale microscoop om embryo's te zien die op de bodem van een agarosedruppel zijn gemonteerd. Prikkel roGFP2-Orp1 en verkrijg overeenkomstige beelden met de gewenste emissiefilters. Verkrijg z-stacks met een doorsnededikte van vijf micrometer door het gewenste deel van de embryo's.

Verwijder na beeldvorming embryo's uit Agarose met fijne tang en bewaar ze in de incubator en methyleenblauwvrije media met fenylthiothine tot de gewenste leeftijd. Een representatief beeld van de waterstofperoxide biosensor en gekweekte zebravis RGC verlengde axonen is hier te zien. Het cellichaam, axon en groeikegels zijn duidelijk zichtbaar in individuele neuronen.

De toevoeging van waterstofperoxide aan de cultuurmedia verhoogt de verhoudingswaarden, wat aantoont dat real-time veranderingen met dit systeem kunnen worden gedetecteerd. Kwantificering van waterstofperoxideniveaus wordt getoond in panel B.To waterstofperoxideniveaus in hele zebravisembryo's te bepalen, werd het mRNA geïnjecteerd tijdens de fase van één cel, waardoor alle weefsels de roGFP2-Orp1-biosensor uitdrukken. Het hoofdgebied van zebravislarven wordt op twee verschillende tijdstippen getoond, gericht op de waterstofperoxideniveaus in het netvlies.

De basale niveaus van waterstofperoxide in de zebravisembryo's na de bevruchting en vijf dagen na de bevruchting werden gemeten. Na twee dagen na de bevruchting waren de verhoudingswaarden aanzienlijk lager dan bij vijf dagen na de bevruchting. Bovendien vertoonde elk dier een andere mate van toename van hun retinale waterstofperoxidegehalte.

Het gebruik van fijne tangen voor het verwijderen van de ogen en zachte dissociatie van de ogen met de pipet zijn de meest kritieke stappen in deze procedure. Dit protocol kan worden gevolgd door medicamenteuze behandelingen om de factoren te onderzoeken die betrokken zijn bij ROS-signalering.