Met een hoge resolutie Live-Imaging van cel gedrag in de ontwikkelingslanden Neuroepithelium
April 12th, 2012
Imaging embryonaal weefsel in real-time is een uitdaging gedurende een lange periode van tijd. Hier presenteren we een test voor het toezicht cellulaire en sub-cellulaire veranderingen in de chick ruggenmerg gedurende lange perioden met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Deze techniek kan worden aangepast voor andere gebieden van het zenuwstelsel en zich ontwikkelende embryo.
Het algemene doel van deze procedure is om celgedrag binnen de embryonale neurale buis met hoge resolutie gedurende langere tijd te beeldvormen. Dit wordt bereikt door eerst de vroege neurale buis te doorsnijden met een construct dat de expressie aandrijft van een fluorescerende eiwit van keuze om enkele cellen te markeren. De volgende stap is om plakjes van het vroege embryo te maken en deze op glazen bodemschalen te plaatsen.
Na herstel in een incubator worden de embryo-sneden op een breedveldmicroscoop met regelmatige tussenpozen beeldvormd. Uiteindelijk kan deze techniek worden gebruikt om celgedrag binnen het zich ontwikkelende neuro-epitheel gedurende langere tijd met hoge ruimtelijke en temporele resolutie te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden voor het beeldvormen van levend weefsel is dat het ons in staat stelt om het gedrag van individuele cellen gedurende langere tijd met hoge ruimtelijke en temporele resolutie te observeren.
Deze methode stelt u in staat om belangrijke vragen in het veld van ontwikkelingsneurobiologie te beantwoorden, zoals de rol van mitotische spindel oriëntatie in sulfaatkeuze, of hoe signaaldynamica het celgedrag kan reguleren. Voorafgaand aan elektroporatie van plasmiden in de neurale buis. Glasnaalden worden bereid met behulp van een micro capillair puller onder een dissectiemicroscoop. Gebruik fijne pincetten om de punt van de naald af te breken.
De uiteinden van de naald moeten scherp genoeg zijn om de neurale buis te doorboren, maar niet zo smal dat het de injectie van de DNA-oplossing belemmert. De X voor dit experiment zijn gedurende ongeveer 36 uur bij 37 graden Celsius geïncubeerd om Hamilton Stage 10 te bereiken.
Om met deze procedure te beginnen, venster en ei en plaats elektroden vijf millimeter uit elkaar aan weerszijden van het embryo, injecteer DNA in de neurale buis. Het DNA is gekleurd met een kleine hoeveelheid fast green voor visualisatie. Pas een stroom van 12 tot 17 volt en 50 milliseconde pulslengte toe, driemaal met 950 milliseconden tussen de pulsen.
Lage concentraties van DNA en lage elektroporatiespanningen worden gebruikt om mozaïekexpressie te bereiken, zodat individuele cellen kunnen worden gevolgd. Bedek tenslotte het venster in de eischaal met cellertape, zorg ervoor dat het goed afsluit. Laat de embryo's drie tot vier uur of een nacht herstellen bij 37 graden Celsius.
Het collageenmengsel en het snedencultuurmedium moeten ongeveer een uur voordat de embryo's worden gesneden worden bereid. Om het collageenmengsel te bereiden, 100 microliter van 0,1%azijnzuur oplossing tot 300 microliter van type één collageen en volledig door elkaar roeren, voeg 100 microliter van vijf keer L 15 medium toe en roer volledig door elkaar. Nogmaals, de oplossing moet geel worden.
Voeg vervolgens 15 tot 20 microliter van 7,5%natriumbicarbonaat toe en roer volledig door elkaar. De oplossing moet licht roze worden. Houd op ijs.
Deze collageenmix moet elke keer vers worden bereid. Om het snedencultuurmedium te bereiden, voeg de volgende toe aan 10 milliliter van neuro basaal medium, B 27 supplement glut max en Gentamycin oplossing, plaats het medium in een incubator van 37 graden Celsius, gebufferd met 5%koolstofdioxide. Laat de bovenkant van de container los om het ten minste een uur te laten gelijkwaardig zijn met de koolstofdioxide.
Om met deze procedure te beginnen, gebruik een paar kleine scharen om het embryo uit te snijden. Verwijder het embryo uit het ei met pincetten en was L 15 medium. Plaats het embryo in een weefselkweekschaal met een laagje syl guard op de bodem.
Prik het embryo door de omringende extra embryonale membranen heen, zodat de membranen strak gespannen zijn. Gebruik een micromes om het embryo zo recht mogelijk door het gebied van belang te snijden. Voor ruggenmergsneden moeten de sneden tussen één en twee somieten dik zijn. De sneden moeten aan het laterale weefsel van het embryo worden bevestigd, zodat ze niet verloren gaan terwijl andere embryo's worden gesneden.
Een aangepaste micro perpetuumtip is nodig voor het overbrengen van de ruggenmergsneden naar de glazen bodemschaal. Om dit voor te bereiden, bevestig een 200 microlitertip aan een P twee of P 10 permanent en snijd ongeveer een millimeter van het uiteinde van de tip af. Codeer de binnenkant van de tip met collageen door een microliter van de eerder bereide collageenmix voor te bereiden.
Laat een tot twee minuten staan en spoel vervolgens met L 15 medium. Dit voorkomt dat het weefsel aan de binnenkant van de tip blijft plakken. Los nu een plakje van het embryo los met behulp van een micromes en verwijder de plakje uit de schaal met behulp van de P twee of P 10 voorzien van de 200 microlitertip.
Probeer zo min mogelijk medium op te nemen. Roer de collageenmix door elkaar en laat vijf tot acht microliter ervan vallen op een met polyol lysine gecoate glazen bodemschaal met een dekglas als basis, plaats onmiddellijk de embryoplakje in het collageen en positioneer het met een paar fijne pincetten. LICs moeten zo worden gepositioneerd dat de te beeldvormen zijde vlak staat met het dekglas.
Het weefsel moet hechten aan de polyol lysine coating op het dekglas. Herhaal dit totdat u verschillende plakjes op het dekglas hebt. Meestal worden zes tot negen plakjes op één schaal geplaatst.
Wanneer alle plakjes op hun plaats zitten, voegt u twee tot drie microliter van L 15, medium toe aan de vroegste plaats collageen en bedek de schaal. Laat het collageen 20 minuten staan. Zodra het collageen is gestold, voegt u voorzichtig twee milliliter snedencultuurmedium toe dat gedurende ten minste een uur in 5%koolstofdioxide en 37 graden Celsius is geëgaliseerd.
Er moet voorzichtig worden omgegaan met het collageen van het dekglas om het niet los te maken, plaats in een incubator van 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide en laat de sneden minstens drie uur herstellen
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe assay voor het visualiseren van cellulaire en subcellulaire veranderingen in het ruggenmerg van kippen over langere perioden met hoge ruimtelijke en temporele resolutie. De techniek is aanpasbaar voor verschillende regio's van het zenuwstelsel en ontwikkelende embryo's.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Het visualiseren van embryonaal weefsel in real-time is uitdagend.
- Bestaande methoden hebben vaak niet de resolutie of duur nodig voor gedetailleerde studies.
- Beeldvorming met hoge resolutie is cruciaal voor het begrijpen van celgedrag tijdens ontwikkeling.
- Deze techniek maakt het mogelijk om het gedrag van individuele cellen over tijd te observeren.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor langetermijnbeeldvorming van celgedrag in de embryonale neurale buis.
- Om de ruimtelijke en temporele resolutie in beeldvormingstechnieken te verbeteren.
- Om sleutelvragen in de ontwikkelingsneurobiologie aan te pakken.
Gebruikte methoden
- Transectie van de vroege neurale buis met een construct van fluorescent eiwit.
- Voorbereiding van embryo slice en montage op glazen bodem schalen.
- Beeldvorming met behulp van breedveldmicroscopie op regelmatige intervallen.
- Gebruik van specifieke kweekcondities om de weefselviabiliteit tijdens beeldvorming te behouden.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van het gedrag van individuele cellen over langere perioden.
- Hoge ruimtelijke en temporele resolutie bereikt met de ontwikkelde techniek.
- Inzichten in de dynamica van celgedrag binnen het zich ontwikkelende neuro-epitheel.
- Mogelijke toepassingen in het bestuderen van oriëntatie van mitotische spindels en signaaldynamica.
Conclusies
- De methode biedt een belangrijke vooruitgang in de beeldvorming van embryonaal weefsel.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek in de ontwikkelingsneurobiologie.
- Verdere aanpassingen kunnen de toepasbaarheid over verschillende regio's van het zenuwstelsel verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding dynamic cell behavior in developing tissues is critical for de-risking target validation in neurodevelopmental disorders. This imaging approach enables high-resolution, longitudinal observation of progenitor cell dynamics, supporting mechanistic insights into signaling pathways that govern cell fate decisions. Such predictive confidence aids in prioritizing targets with stronger translational potential early in discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing how signaling perturbations affect progenitor cell division and differentiation in real time.
- Operational Value: Provides quantitative, sub-cellular resolution data on mitotic dynamics and process inheritance to clarify pathway-specific effects.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by linking molecular interventions to observable changes in cell behavior over extended periods.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible embryonic tissue preparations suitable for compound or genetic perturbation screening.
- Quantitative Output: Delivers high-spatiotemporal-resolution time-lapse data enabling precise measurement of division orientation, timing, and inheritance patterns.
- Scalability: Supports multi-slice imaging per dish, increasing throughput for comparative condition testing in discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Offers a human-relevant embryonic model to study conserved mechanisms of neuroepithelial patterning disrupted in developmental disorders.
- Translational Continuity: Bridges discovery observations with preclinical validation by establishing causal links between target modulation and phenotypic outcomes in tissue context.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from direct effects on progenitor behavior versus secondary consequences, improving target confidence.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, providing mechanistic readouts that inform go/no-go decisions before significant investment.
- Discovery Biology: Enables direct testing of how candidate modulators alter progenitor cell division symmetry, orientation, and inheritance in a developing tissue context.
- Screening: Yields standardized, imaging-ready slices with consistent viability, supporting reproducible compound exposure and phenotype detection.
- Analytics: Generates quantitative metrics on division timing, cleavage plane orientation, and cytoplasmic inheritance for objective condition comparison.
- Translational Research: Connects molecular perturbations to emergent tissue-level behaviors, supporting biomarker-aligned phenotypic anchoring in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable across multiple neurodevelopmental targets and signaling pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking target engagement to dynamic cellular phenotypes in a physiologically relevant system.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized slice culture and environmental control, minimizing variability in longitudinal imaging.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early elimination of targets lacking desired effects on progenitor behavior dynamics.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of target modulation on disease-relevant cellular processes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic tissue handling, electroporation, and live imaging to ensure slice viability and data quality.
- Dependent on wide-field fluorescence microscopy with environmental control for long-term, high-resolution time-lapse acquisition.
- Necessitates standardized protocols for collagen-based embedding and medium equilibration to maintain consistent tissue adhesion and physiology.
- Adaptation across model systems may require optimization of slice thickness, culture conditions, and fluorescent reporter expression levels.
- Practical limitations include the technical complexity of embryo preparation and the need for precise environmental control to prevent phototoxicity and drift.
