Name: Met een hoge resolutie Live-Imaging van cel gedrag in de ontwikkelingslanden Neuroepithelium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Leer hoe je celgedrag in het embryonale neurale buisje van kippenembryo's kunt visualiseren met hoge resolutie gedurende langere tijd. Deze techniek maakt gedetailleerde studies van neuro-epitheelontwikkeling mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Schotel Voorbereiding <ol><li> Schotels voor slice cultuur zijn glazen bodem (met een dekglaasje aan als de basis) (Willco gerechten). Deze worden geplaatst op de lens weefsel in een 6 cm weefselkweek schotel te houden van de glazen bodem schoon. </li><li> Op de dag voor de proef 2 ml 0,1% poly-L-lysine oplossing van het glazen bodem schaal en incubeer 5min bij kamertemperatuur om de poly-L-lysine het bekleden van de glazen bodem. </li><li> Verwijder poly-L-lysine oplossing en spoel drie keer in gedemineraliseerd water bij en dan een keer in 70% ethanol. </li><li> Laat een nacht drogen. Gerechten kunnen ook worden gedroogd door voorzichtige verwarming in een magnetron op laag vermogen gedurende 30-45 seconden. </li></ol> 2. Embryo Elektroporatie <ol><li> Incubeer eieren bij 37 ° C Hamburger-Hamilton (HH) fase 10 (~ 36 uur) (of andere gewenste stap). </li><li> Alvorens te beginnen met de voorbereiding glas naalden (wij gebruik van een Flaming / bruin model P87 microcapillaire trekker) en breek het topje van de needle met een fijne pincet onder een stereomicroscoop. Het einde van de naald scherp genoeg zijn om doorboren embryo hoewel niet zo nauw, dat het injecteren van de DNA-oplossing belemmert. </li><li> Raam eieren plaats elektroden (5mm elkaar) aan weerszijden van de embryo </li><li> Injecteer DNA (~ 0,025 tot 0,5 pg / pl in gedeïoniseerd water gekleurd met een kleine hoeveelheid Fast Green) in de neurale buis. </li><li> Breng de huidige - 12-17 V drie keer, 50ms pulslengte met 950 ms tussen pulsen. </li><li> We maken gebruik van lage concentraties van DNA-en laag elektroporatie spanningen te mozaïek expressie te komen, zodat we kunnen volgen individuele cellen. </li><li> Bedek venster in de eierschaal met plakband en zorg ervoor dat wordt verzegeld. </li><li> Laat embryo&#39;s 3-4 uren of herstellen bij 37 ° C. </li></ol> 3. Collageen en Slice Cultuur Medium Voorbereiding <ol><li> Bereid collageen mix en plak kweekmedium ongeveer een uur alvorens te snijden. </li><li> Aan 300 pi type 1 collageen voeg 100 ul 0,1% azijnzuur en 100 ul 5 x L15 medium. Vortex grondig na elke toevoeging. De oplossing moet geel. </li><li> Nu Voeg 15-20 ul 7,5% natriumbicarbonaat en grondig vortex. De oplossing moet lichtroze en het volume van natriumbicarbonaat voor deze verschillen. Houd op het ijs en make-up verse per keer. </li><li> Aan 10 ml neurobasal medium toe te voegen B-27 supplement en Glutamax, op een 1 x eindconcentratie en 10 ul Gentamicine oplossing. </li><li> Plaats medium in een 37 ° C incubator gebufferd met 5% CO2. Laat de bovenkant van de houder los zodat het equilibreren van de CO2. </li></ol> 4. Slice Cultuur <ol><li> Verwijder de embryo&#39;s van ei en wassen in L15 medium. </li><li> Plaats in een weefselkweek schotel met een laag Sylgard onderaan en pen ze door het omringende extra-embryonale membranen zodat deze bespannen. </li><li> Met behulp van een microfoonroknife, slice embryo zo recht mogelijk door regio van belang. Voor het ruggenmerg, moet plakken zijn tussen 1-2 somieten dik. Laat plakken aan embryo&#39;s, terwijl je slice andere embryo&#39;s, zodat je niet verliezen. </li><li> Bereid een 200 ul micropipet tip door het afsnijden ~ 1 mm van de punt en verbonden naar een p2 of p10. Dit uiteinde zal worden gebruikt om het ruggenmerg segmenten dragen aan de glazen onderste schaal. Een 10 ul tip is niet breed genoeg is op te halen plakjes. </li><li> Smeer de binnenkant van de tip met collageen door pipetteren 1 pi collageen mix eerder voorbereid. Laat gedurende 1-2 minuten en spoel het daarna met L15 medium. Dit voorkomt het weefsel hechten aan de binnenzijde van de tip. </li><li> Maak slice van embryo met behulp van een microknife en haal hem uit de schotel met een P2 of P10 uitgerust met een 200 ul tip en ingesteld op 1 pl. Probeer om zo weinig medium mogelijk. </li><li> Vortex de collageen mix en drop 5-8 pi van dit op de poly-L-lysine gecoate schaal. </li><li> Defimediately zet embryo snij ze in collageen en positie op zijn plaats met een paar fijne pincet. Slices moet worden geplaatst, zodat de kant af te beelden is gelijk met de dekglaasje aan. Het weefsel moet voldoen aan de poly-L-lysine coating op het dekglaasje. </li><li> Herhaal dit tot je een paar plakken op het dekglaasje aan. We kunnen gewoonlijk plaats 6-9 plakjes op een schotel. </li><li> Als alle plakken op hun plaats, bedek de schotel en laat het collageen in te stellen gedurende 20 minuten. Enkele van de vroegste geplaatst collageen misschien al begon op te drogen. Om te voorkomen dat een kleine hoeveelheid L15 aan deze voor bekleding. </li><li> Eenmaal ingesteld, zorgvuldig toe te voegen 2 ml slice kweekmedium dat is geëquilibreerd in 5% CO2 bij 37 ° C gedurende ten minste een uur. Er moet worden genomen om niet verdrijven het collageen van de dekglaasje aan. </li><li> Plaats in een 37 ° / 5% CO2 incubator en laat plakjes tot tenminste 3 uren herstellen voordat beeldvorming. Als er geen vochtigheid, de schotel in een perspex box witha beetje vochtig vloeipapier in een hoek. </li></ol> 5. Imaging Embryo Slices <ol><li> We gebruiken een DeltaVision Core wide-field microscoop uitgerust met een Weerstation klimaatkamer om de afbeelding te plakken. De kamer wordt constant op 37 ° C met een CO2 perfusie de toestel microscooptafel handhaven op 5% CO2 / 95% lucht. </li><li> Imaging wordt normaal gesproken uitgevoerd met een 40 x / 1,30 NA olie-immersie lens en de beelden worden vastgelegd met een CoolSNAP HQ2 gekoeld CCD-camera. </li><li> Z-profielen zijn vastgelegd om 1,5 pm tot 45 pm weefsel. Sluitertijd moet zo laag mogelijk. We normaal gesproken bloot voor 5-50 ms voor elk Z-sectie. Beelden worden vastgelegd om de 7 minuten en maximaal 9 plakjes kan worden bezocht via het DeltaVision systeem precieze punt bezoek functie. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Een voorbeeld time-lapse sequentie van een ruggenmerg progenitor celFig. 2a en bijbehorende Movie 1. Imaging is gestart op een ruggenmerg plak van een twee dagen oude (HH stadium 12) embryo. Deze cel getransfecteerd met een construct tot expressie GFP-αTubulin. In dit vroege stadium, neurale stamcellen ondergaan voornamelijk progenitor-voorlopercellen mode divisies waarin de cellen zich delen twee extra fietsen stamcellen te genereren. Fig. 2b en bijbehorende film 2 toont een cel getransfecteerd met GFP-GPI (GPI verankerd GFP) het markeren van de celmembraan. Deze cel ondergaat een divisie waarin de basale proces splitst in twee en is eveneens overgenomen door de dochter cellen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig1.jpg" /> Figuur 1. Slice cultuur protocol voor time-lapse imaging. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig2.jpg" /> Figuur 2. Cell behavior tijdens de normale ontwikkeling van het ruggenmerg. (a) Geselecteerde frames van Movie 1. Cell expressie GFP-tubuline verdeelt een splitsing vlak loodrecht op de apicale oppervlak (2 h 20 min), het opwekken van twee dochtercellen die delen weer (24 h 23 min en 25 h 54 min). (B) Geselecteerde frames van Movie 2. Cel getransfecteerd met GFP-GPI ondergaat de celdeling gedurende welke de basale proces wordt gesplitst (witte pijlen) en ook overgenomen door de dochter cellen. Movie 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Klik hier om film te bekijken</a> . Movie 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Klik hier om film te bekijken</a> .

<ol><li>Ulloa, F., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogens+and+the+Control+of+Cell+Proliferation+and+Patterning+in+the+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord.</a> Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).</li>
<li>Briscoe, J., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+pathways+linking+progenitor+patterning%2C+cell+fates+and+neurogenesis+in+the+ventral+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).</li>
<li>Shiau, C., Das, R., Storey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+assay+for+high+cellular+resolution+time-lapse+imaging+of+sensory+placode+formation+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis.</a> BMC Neuroscience. 12, 37(2011).</li>
<li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li>
<li>Vilas-Boas, F., Fior, R., Swedlow, J. R., Storey, K. G., Henrique, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+reporter+of+notch+signalling+indicates+regulated+and+random+notch+activation+during+Vertebrate+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel reporter of notch signalling indicates regulated and random notch activation during Vertebrate neurogenesis.</a> BMC Biology. 9, 58(2011).</li>
<li>Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bios+Scientific+Publishers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Bios Scientific Publishers. , (1998).</li>
<li>Conchello, J. -A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Meth. 2, 920-931 (2005).</li>
<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Fundamental+Limits+in+Confocal+Microscopy+Handbook+Of+Biological+Confocal%22">Fundamental Limits in Confocal Microscopy Handbook Of Biological Confocal</a>. Pawley, J. B. , Springer US. (2006).</li>
<li>Swedlow, J. R., Hu, K., Andrews, P. D., Roos, D. S., Murray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+tubulin+content+in+Toxoplasma+gondii%3A+A+comparison+of+laser-scanning+confocal+and+wide-field+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Measuring tubulin content in Toxoplasma gondii: A comparison of laser-scanning confocal and wide-field fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 2014-2019 (2002).</li>
<li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+performance+in+three-dimensional+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 228, 390-405 (2007).</li>
<li>Biggs, D. S. C. 3D Deconvolution Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBiggs%2C+DSC+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22">Current Protocols in Cytometry</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging%3A+Opportunities%2C+limitations%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We presenteren hier een nieuwe time-lapse imaging test naar cel gedrag in kip embryonale slice cultuur te bewaken. Deze test zorgt voor een hoge resolutie beeldvorming van levend weefsel tot 70 uur, hoewel de tijd frames tussen 24-48 uur zijn gemakkelijker te vangen. Het gebruik van een hoge NA olie objectief en relatief korte intervallen tussen de tijdstippen maakt beeldacquisitie met een hoge resolutie, maar ook zodat we cel gedrag dat vaak voorkomt snel volgen, en kan gemakkelijk worden gemist tijdens de conventionele time-lapse imaging met behulp van confocale microscopie. Het grote voordeel van deze test is de mogelijkheid om beeld cellen gedurende lange perioden. Het gebruik van wide-field 6 in plaats van confocale laser scanning microscopie 7 is van cruciaal belang voor deze. Confocale microscopie is van oudsher aangeboden een aantal voordelen ten opzichte van breed-veld microscopie, inclusief de mogelijkheid om optische secties te nemen en te elimineren onscherp informatie direct <sup&gt; 7, maar het gebruik van een pinhole leidt tot een verlies van licht de detector 8, zonder een aanzienlijke hoeveelheid informatie, en noodzaak langere belichtingstijden. Brede microscopie, anderzijds, gebruikt vol-belichting en al het licht door het objektiefstelsel wordt naar de detector. In combinatie met een hoog kwantumrendement afgekoeld coupled device (CCD) camera zorgt beeldvorming met een hoge signaal-ruisverhouding ten opzichte van confocale microscopie 9 zeer snel belichtingstijden. In onze toepassing, moeten we de afbeelding voor een langere tijd, record 3D-stapels en uiteindelijk op te lossen kleine-bijna-diffractie beperkte structuren. Hoewel confocale microscopie voorkomt out-of-focus licht ooit op de detector en dus vermindert de achtergrond in de dikke, dicht-gelabelde monsters 7, 8, levert hij slechts een bruikbaar signaal-ruis-verhouding met een veel grotere lichtinval dan breed- microscopie 10. Voor zeer lichtgevoelige sparsely-gelabelde monsters zoals onze geëlektroporeerde ruggenmerg plakken, daarom breed-veld microscopie beter presteert dan confocale microscopie. In combinatie met beeld restauratie door deconvolutie, die verwijdert onscherp informatie en verbetert contrast, wide-field is dan bijzonder goed voor de detectie van kleine, afm voorwerpen 11. Hoewel niet geschikt is voor elk weefsel imaging experiment, heeft deze aanpak zeer effectief voor onze live cell imaging-toepassing. De keuze van fluorescerend eiwit is een belangrijke factor celoverleving kunnen beïnvloeden. We merken dat de beste resultaten worden verkregen constructen die green fluorescent protein (GFP) 12 als een marker. We zijn momenteel de beoordeling van een aantal rode fluorescerende eiwitten die effectief kan worden gebruikt in combinatie met GFP voor het dual channel tijd vervalt. Er zijn een verscheidenheid aan eiwitten beschikbaar 13. Hoewel vele eiwitten stabiel fusies met een fluorescerend eiwitKunnen sommige eiwitten worden gemaakt instabiel door de fusie, wat resulteert in een verminderde levensvatbaarheid van de cellen. In dergelijke gevallen is het gebruik van constructen met een interne ribosomale toegangsplaats (IRES) is nuttig om het eiwit van belang te scheiden van de fluorescent eiwit. Bij beeldvorming ruggenmerg plakken, moeten maatregelen genomen worden om blootstelling aan TL-licht te minimaliseren. De microscoop oculairs mag alleen worden gebruikt met doorvallend licht (helderveld) te lokaliseren en positie plakjes. TL-beelden moeten altijd worden verworven met behulp van de microscoop software met behulp van minimale blootstelling tijden. Deze moeten worden bewaard in de range van 5-50 ms en het gebruik van grijsfilters moet worden geëxperimenteerd. Hoewel de langere belichtingstijden kan in eerste instantie produceren scherpere beelden, kunnen de fototoxische effecten van TL-licht blootstelling leiden tot celdood. De eerste 5-10 um van weefsel dat het dichtst bij het dekglaasje mag niet worden afgebeeld, omdat dit gebied bevat weefsel die zijn beschadigd tijdenssnijden. Hoewel de voorbeelden hier gepresenteerde zijn van embryo&#39;s geëlektroporeerd bij HH stadium 10 en verbeelde 6-7 uur later, kan deze methode worden gebruikt om embryo&#39;s tot stadium 18 HH. In latere stadia, het ruggenmerg weefsel is veel groter en dus is moeilijk te snijden met de hand. In deze gevallen kan het inbedden van de embryo&#39;s in laag-smeltpunt agarose en snijden met een vibratome betere resultaten. Hoewel we deze assay presenteren als een werkwijze voor beeldvorming cellen in het ontwikkelende ruggenmerg is deze benadering ook aangepast aan andere afbeelding embryonale weefsel, inclusief de sensorische placodes 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Willco Dish </td><td> Willco Wells </td><td> GWst-3522 </td><td></td></tr><tr><td> poly-L-lysine </td><td> Sigma </td><td> P8970 </td><td> 0,1% in Tris </td></tr><tr><td> Borosilicaatglas haarvaten </td><td> Harvard Instrumenten </td><td> GC100-10 </td><td> 1,0 mm buitendiameter 0.58mm binnendiameter </td></tr><tr><td> Elektroden (Genetrodes in ovo, L-vormige </td><td> BTX </td><td> 10-001850-01 </td><td> 5mm verguld </td></tr><tr><td> ECM 830 vierkante pulsgenerator </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td> voor de in-ovo electroopration </td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Sigma </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> Type I collageen rat </td><td> Sigma </td><td> C3857 </td><td></td></tr><tr><td> L-15-medium (poeder) </td><td> Sigma </td><td></td><td> 2,76 g / L in gedestilleerd water voor 5x oplossing </td></tr><tr><td> Natriumbicarbonaat </td><td> Sigma </td><td> S8761 </td><td> 7,5% oplossing </td></tr><tr><td> Neurobasal medium </td><td> Invitrogen </td><td> 12348-017 </td><td> zonder fenolrood </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> A1286001 </td><td> 100x oplossing </td></tr><tr><td> B-27 supplement </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicine </td><td> Invitrogen </td><td> 15710049 </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td> L15 medium (vloeistof 1x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Altomed </td><td> A10102 </td&gt; <td> 15 graden helling </td></tr><tr><td> RVS zonder kop pinnen </td><td> Watkins en Doncaster </td><td> E6871 </td><td> A1-formaat </td></tr><tr><td> Sylgard 184 elastomeer </td><td> VWR </td><td> 634165S </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision Core microscoop systeem </td><td> Toegepaste Precision </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coolsnap HQ2 CCD-camera </td><td> Photometrics </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

met een hoge resolutie live-imaging van cel gedrag in de ontwikkelingslanden neuroepithelium

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

De embryonale ruggenmerg bestaat uit fietsen neurale stamcellen die aanleiding geven tot een groot percentage van de neuronale en gliale cellen van het centrale zenuwstelsel (CZS). Hoewel veel bekend is over de moleculaire mechanismen die patroon het ruggenmerg en uitlokken neuronale differentiatie 1, 2, missen we een diep begrip van deze vroege gebeurtenissen op het niveau van cel gedrag. Het is derhalve essentieel om het gedrag van neurale voorlopercellen in real time bestuderen zij ondergaan neurogenese. In het verleden, real-time beeldvorming van de vroege embryonale weefsel is beperkt door cel / levensvatbaarheid van het weefsel in de cultuur en de fototoxische effecten van fluorescerende beeldvorming. Hier presenteren we een nieuwe test voor het afbeelden van dergelijke weefsels voor langere tijd, met behulp van een nieuwe ex vivo slice cultuur-protocol en wide-field fluorescentie microscopie (afb. 1). Deze aanpak bereikt op lange termijn time-lapse monitoring van kuiken embryo&#39;sPinal koord progenitorcellen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Deze test kan worden gewijzigd op het beeld een reeks embryoweefsel 3, 4 naast de waarneming van cellulaire en subcellulaire gedrag de ontwikkeling van nieuwe en gevoelige reporters voor genactiviteit (bijvoorbeeld Notch signalering 5) dit assay een krachtig instrument om te begrijpen hoe het signaleren reguleert cel gedrag tijdens de embryonale ontwikkeling.

Imaging embryonaal weefsel in real-time is een uitdaging gedurende een lange periode van tijd. Hier presenteren we een test voor het toezicht cellulaire en sub-cellulaire veranderingen in de chick ruggenmerg gedurende lange perioden met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Deze techniek kan worden aangepast voor andere gebieden van het zenuwstelsel en zich ontwikkelende embryo.

Met een hoge resolutie Live-Imaging van cel gedrag in de ontwikkelingslanden Neuroepithelium

Het embryonale ruggenmerg bestaat uit cyclende neurale progenitorcellen die een groot percentage van de neuronale en gliale cellen van het centrale...

Het algemene doel van deze procedure is om het celgedrag binnen de embryonale neurale buis gedurende lange perioden met een hoge resolutie in beeld te brengen. Dit wordt bereikt door eerst de vroege neurale buis te transfecteren met een construct dat de expressie aanstuurt van een fluorescerend eiwit naar keuze om individuele cellen te markeren. De volgende stap is om coupes van het vroege embryo te maken en deze te monteren op glazen bodemplaatsjes.Na herstel in een incubator worden de embryosnijplaatjes op regelmatige intervallen afgebeeld met een breedveldmicroscoop. Uiteindelijk kan deze techniek worden gebruikt om het celgedrag binnen het ontwikkelende neuro-epitheel over lange perioden te bestuderen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor het afbeelden van levend weefsel is dat het ons in staat stelt om het gedrag van individuele cellen over lange perioden met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie te observeren.Deze methode stelt u in staat om kernvragen binnen het vakgebied van de ontwikkelingsneurobiologie te adresseren, zoals de rol van de oriëntatie van de mitotische spoel bij de keuze voor het substraat, of hoe signaleringsdynamiek het celgedrag zou kunnen reguleren. Voorafgaand aan de electroporatie van plasmiden in de neurale buis worden glazen naalden geprepareerd met een micro-capillaire trekker onder een dissectiemicroscoop. Gebruik een fijne pincet om de punt van de naald af te breken.Het uiteinde van de naald moet scherp genoeg zijn om de neurale buis te doorboren, maar mag niet zo nauw zijn dat de injectie van de DNA-oplossing wordt belemmerd. De embryo's voor dit experiment zijn ongeveer 36 uur bij 37 graden Celsius geïncubeerd om Hamilton stage 10 te bereiken.Om deze procedure te starten, wordt het ei gewindowd en worden elektroden met een tussenruimte van vijf millimeter aan weerszijden van het embryo geplaatst, waarna DNA in de neurale buis wordt geïnjecteerd. Het DNA is gekleurd met een kleine hoeveelheid fast green voor visualisatie. Pas drie keer een stroom van 12 tot 17 volt toe met een pulslengte van 50 milliseconden en een interval van 950 milliseconden tussen de pulsen.Lage concentraties DNA en lage electroporatiespanningen worden gebruikt om mozaïekexpressie te bereiken, zodat individuele cellen kunnen worden gevolgd. Bedek tot slot het venster in de eierschaal met plakband (cellofaan tape) en zorg dat dit goed is afgesloten. Laat de embryo's drie tot vier uur of een nacht herstellen bij 37 °C.Het collageenmengsel en het kweekmedium voor coupes moeten ongeveer een uur vóór het snijden van de embryo's worden bereid. Om het collageenmengsel te bereiden, voegt u 100 µL van een 0,1% azijnzuuroplossing toe aan 300 µL type I collageen en mengt u dit grondig met een vortexmixer. Voeg vervolgens 100 µL van een 5× L 15-medium toe en meng opnieuw grondig met de vortexmixer. De oplossing moet nu geel van kleur worden.Voeg vervolgens 15 tot 20 µL 7,5% natriumbicarbonaat toe en vortex grondig. De oplossing moet lichtroze worden. Bewaar op ijs.Dit collageenmengsel moet elke keer vers worden bereid. Om het kweekmedium voor de coupes voor te bereiden, voegt u toe aan de volgende 10 milliliters neurobasaal medium, B 27-supplement, glutmax en gentamycine-oplossing. Plaats het medium in een incubator van 37 °C, gebufferd met 5% koolstofdioxide. Laat de bovenkant van de container loszitten zodat het medium gedurende ten minste een uur kan equilibreren met de koolstofdioxide.Om deze procedure te starten, gebruik een klein schaartje om het embryo uit te snijden. Verwijder het embryo uit het ei met een pincet en spoel dit met L 15 medium. Plaats het embryo in een weefselkweekschaal met een laag syl guard op de bodem.Zet het embryo vast door de omringende extra-embryonale membranen, zodat de membranen strak gespannen staan. Snijd het embryo met een micro-mes zo recht mogelijk door het gebied van belang. Voor het ruggenmerg moeten de coupes een dikte van één tot twee somieten hebben; bevestig de bladcoupes aan het laterale weefsel van het embryo zodat ze niet verloren gaan terwijl andere embryo's worden gesneden.Er is een aangepaste micro-perpet-tip nodig om de dwarsdoorsneden van het ruggenmerg over te brengen naar de glazen bodemschaal. Bereid deze voor door een 200 µL tip op een P2 of P10 pipet te plaatsen en ongeveer 1 mm van het uiteinde van de tip af te knippen. Coat de binnenkant van de tip met collageen door 1 µL van het eerder bereide collagenmengsel aan te brengen.Laat dit één tot twee minuten inwerken en spoel vervolgens met L 15-medium. Dit voorkomt dat het weefsel aan de binnenkant van de tip blijft kleven. Snijd nu met een micro-mes een plakje uit het embryo en verwijder het plakje uit de schaal met de P 2 of P 10, voorzien van de 200 µL tip.Probeer zo min mogelijk medium op te nemen. Vortex het collagenmengsel en breng vijf tot acht microliters hiervan aan op een met poly-L-lysine gecoate glazen schaaltje met een dekglas als basis; plaats onmiddellijk de embryonale slice in het collageen en positioneer deze met een fijne pincet. De LIC's moeten zo worden geplaatst dat de zijde die wordt afgebeeld vlak tegen het dekglas aanligt.Het weefsel moet hechten aan de poly-L-lysine coating op het dekglas. Herhaal dit totdat er meerdere coupes op het dekglas liggen. Gewoonlijk worden er zes tot negen coupes op één schaaltje geplaatst.Wanneer alle coupes op hun plaats liggen, voegt u twee tot drie microliters L 15-medium toe aan de plek van het eerste collageen en sluit u de schaal. Laat het collageen 20 minuten uitharden. Zodra het collageen is uitgehard, voegt u voorzichtig twee milliliters coupeskweekmedium toe dat gedurende ten minste een uur is geëquilibreerd bij 5% koolstofdioxide en 37 °C.Er moet zorgvuldig worden gewerkt om te voorkomen dat het collageen van het dekglas loslaat; plaats het geheel in een incubator op 37 °C met 5% CO2 en laat de coupes minstens drie uur herstellen voordat de beeldvorming plaatsvindt. Het over een langere periode in beeld brengen van celgedrag binnen weefsel met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie is uitdagend. Een combinatie van optimale kweekcondities en het gebruik van witveldmicroscopie is essentieel voor het verkrijgen van goede resultaten.Een delta vision core wide field microscoop, uitgerust met een weather station environmental chamber, wordt gebruikt voor het beelden van de coupes. De kamer wordt constant op 37 °C gehouden met een koolstofdioxide-perfusieapparaat om de microscooptafel op 5% CO2 en 95% lucht te houden. Beeldvorming vindt gewoonlijk plaats met een 40× 1,30 NA olie-immersieobjectief en beelden worden vastgelegd met een core snap HQ two gekoelde CCD-camera. Z-secties worden vastgelegd elke 1,5 µm over een weefselexpositie van 45 µm. De belichtingstijd moet zo laag mogelijk worden gehouden, bijvoorbeeld tussen 5 en 50 milliseconden.Voor elke genoemde sectie worden elke zeven minuten beelden vastgelegd. Met de Delta vision-systemen kunnen tot negen coupes worden bezocht. De hier getoonde nauwkeurige punt-bezoekfunctie is een voorbeeld van een time-lapse-sequentie van een ruggenmerg-progenitorcel die is getransfecteerd met een construct dat GFP alpha Tubulin tot expressie brengt; de beeldvorming is gestart op een ruggenmergcoupe van een twee dagen oud HH-stadium 12 embryo.Tijdens deze vroege fase ondergaan neurale progenitorcellen voornamelijk delingen in de progenitor-progenitor modus, waarbij de cellen delen om twee verdere cyclus-doorlopende progenitorcellen te genereren. Deze figuur toont geselecteerde frames uit de zojuist getoonde time-lapse sequentie. Na twee uur en 20 minuten deelt de cel zich met een delingsvlak dat loodrecht op het apicale oppervlak staat, waarbij twee dochtercellen ontstaan.Deze twee cellen delen zich opnieuw na 24 uur en 23 minuten en na 25 uur en 54 minuten. Deze volgende time-lapse-sequentie is van een cel getransfecteerd met G-F-P-G-P-I dat het celmembraan markeert. Deze cel ondergaat een deling waarbij het basale uitstulping in tweeën splitst, zoals aangegeven door de witte pijlen, en gelijkmatig wordt overgeërfd door de dochtercellen.Geselecteerde frames uit deze time-lapse-sequentie laten zien dat de celdeling plaatsvindt op nul uur en 49 minuten. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u ruggenmergplakjes voorbereidt en afbeeldt. Houd er rekening mee dat u, indien u nieuw bent met deze techniek, in het begin mogelijk problemen ondervindt, aangezien er een aantal technisch uitdagende stappen zijn die allemaal moeten samenkomen om dit te laten slagen.

high-resolution-live-imaging-cell-behavior-developing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft beeldvorming van individuele neuronen of neurale cellen in levende zebravis embryo's. Deze methode wordt gebruikt om cellulaire gedrag en actine lokalisatie met behulp van fluorescentie confocal time-lapse microscopie bestuderen.

Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo&#39;s

De huidige video toont een methode die gebruik maakt van de combinatie van elektroporatie en confocale microscopie te leven imaging op individuele neurale stamcellen uit te voeren in de zich ontwikkelende zebravis voorhersenen.

Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

We beschrijven een protocol voor real-time videoimaging van neuronale migratie in de muis voorhersenen. De migratie van viraal gemerkte of geënte neuronale precursors opgenomen in acute levende plakjes met breedveld fluorescerende beeldvorming met een relatief snelle verwerving interval de verschillende fasen van celmigratie, zoals de duur van de stationaire en migratiefasen en de snelheid van bestuderen migratie.

Time-lapse imaging van neuroblast migratie in Acute Schijfjes van de volwassen muis voorhersenen

Hier ontwikkelen we de instrumenten die nodig zijn voor...

Ex vivo Live-Imaging van Single Cell Divisies in Muis neuroepithelium

Dit protocol beschrijft hoe u het delende cellen binnen een weefsel in Caenorhabditis elegans embryo. Terwijl verschillende protocollen beschrijven hoe afbeelding celdeling in de vroege embryo, dit protocol wordt beschreven hoe u foto celdeling binnen een zich ontwikkelende weefsel tijdens midden late embryogenese.

Visualiseren neuroblast Cytokinese Tijdens<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

Progenitorceltransplanten mitose is een kritische parameter van neurogenese. Veel van onze kennis van neurale voorlopercellen mitose is gebaseerd op de analyse van vaste weefsel. Live-beeldvorming in de embryonale hersenen plakjes is een veelzijdige techniek om mitose te beoordelen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in een gecontroleerde omgeving.

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

Levende imaging is een krachtig hulpmiddel om te studeren van cellulaire gedrag in real-time. Hier beschrijven we een protocol voor time-lapse video-microscopie van primaire hersenschors cellen waarmee een gedetailleerd onderzoek van de fasen die onder de progressie van de bloedlijn van primaire neurale stamcellen gedifferentieerde neuronen en glia werden.

Live beeldvorming van primaire hersenschors cellen met behulp van een systeem van 2D cultuur

Een robuust protocol controleren neurale populaties time-lapse video-microscopie gevolgd door softwarematige nabewerking is beschreven. Deze methode geeft een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van biologische gebeurtenissen in een geselecteerde populatie tijdens live imaging experimenten.

Live Imaging gevolgd door eencellige bijhouden van de biologie van de cel van de Monitor en de progressie van de bloedlijn van meerdere neurale populaties

Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ontstaan neuronen en gliacellen in de ventriculaire zone die het ventrikel bekleedt en migreren ze naar het hersenoppervlak. Bij dit proces zijn veel genen betrokken. Dit protocol introduceert de techniek voor de time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen.

Time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in embryonale hersenplakjes van muizen

Leer hoe je celgedrag in het embryonale neurale buisje van kippenembryo's kunt visualiseren met hoge resolutie gedurende langere tijd. Deze techniek maakt gedetailleerde studies van neuro-epitheelontwikkeling mogelijk.

Met een hoge resolutie Live-Imaging van cel gedrag in de ontwikkelingslanden Neuroepithelium

Meer video's verkennen