Met een hoge resolutie Live-Imaging van cel gedrag in de ontwikkelingslanden Neuroepithelium

Het algemene doel van deze procedure is om het celgedrag binnen de embryonale neurale buis gedurende lange perioden met een hoge resolutie in beeld te brengen. Dit wordt bereikt door eerst de vroege neurale buis te transfecteren met een construct dat de expressie aanstuurt van een fluorescerend eiwit naar keuze om individuele cellen te markeren. De volgende stap is om coupes van het vroege embryo te maken en deze te monteren op glazen bodemplaatsjes.

Na herstel in een incubator worden de embryosnijplaatjes op regelmatige intervallen afgebeeld met een breedveldmicroscoop. Uiteindelijk kan deze techniek worden gebruikt om het celgedrag binnen het ontwikkelende neuro-epitheel over lange perioden te bestuderen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor het afbeelden van levend weefsel is dat het ons in staat stelt om het gedrag van individuele cellen over lange perioden met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie te observeren.

Deze methode stelt u in staat om kernvragen binnen het vakgebied van de ontwikkelingsneurobiologie te adresseren, zoals de rol van de oriëntatie van de mitotische spoel bij de keuze voor het substraat, of hoe signaleringsdynamiek het celgedrag zou kunnen reguleren. Voorafgaand aan de electroporatie van plasmiden in de neurale buis worden glazen naalden geprepareerd met een micro-capillaire trekker onder een dissectiemicroscoop. Gebruik een fijne pincet om de punt van de naald af te breken.

Het uiteinde van de naald moet scherp genoeg zijn om de neurale buis te doorboren, maar mag niet zo nauw zijn dat de injectie van de DNA-oplossing wordt belemmerd. De embryo's voor dit experiment zijn ongeveer 36 uur bij 37 graden Celsius geïncubeerd om Hamilton stage 10 te bereiken.

Om deze procedure te starten, wordt het ei gewindowd en worden elektroden met een tussenruimte van vijf millimeter aan weerszijden van het embryo geplaatst, waarna DNA in de neurale buis wordt geïnjecteerd. Het DNA is gekleurd met een kleine hoeveelheid fast green voor visualisatie. Pas drie keer een stroom van 12 tot 17 volt toe met een pulslengte van 50 milliseconden en een interval van 950 milliseconden tussen de pulsen.

Lage concentraties DNA en lage electroporatiespanningen worden gebruikt om mozaïekexpressie te bereiken, zodat individuele cellen kunnen worden gevolgd. Bedek tot slot het venster in de eierschaal met plakband (cellofaan tape) en zorg dat dit goed is afgesloten. Laat de embryo's drie tot vier uur of een nacht herstellen bij 37 °C.

Het collageenmengsel en het kweekmedium voor coupes moeten ongeveer een uur vóór het snijden van de embryo's worden bereid. Om het collageenmengsel te bereiden, voegt u 100 µL van een 0,1% azijnzuuroplossing toe aan 300 µL type I collageen en mengt u dit grondig met een vortexmixer. Voeg vervolgens 100 µL van een 5× L 15-medium toe en meng opnieuw grondig met de vortexmixer. De oplossing moet nu geel van kleur worden.

Voeg vervolgens 15 tot 20 µL 7,5% natriumbicarbonaat toe en vortex grondig. De oplossing moet lichtroze worden. Bewaar op ijs.

Dit collageenmengsel moet elke keer vers worden bereid. Om het kweekmedium voor de coupes voor te bereiden, voegt u toe aan de volgende 10 milliliters neurobasaal medium, B 27-supplement, glutmax en gentamycine-oplossing. Plaats het medium in een incubator van 37 °C, gebufferd met 5% koolstofdioxide. Laat de bovenkant van de container loszitten zodat het medium gedurende ten minste een uur kan equilibreren met de koolstofdioxide.

Om deze procedure te starten, gebruik een klein schaartje om het embryo uit te snijden. Verwijder het embryo uit het ei met een pincet en spoel dit met L 15 medium. Plaats het embryo in een weefselkweekschaal met een laag syl guard op de bodem.

Zet het embryo vast door de omringende extra-embryonale membranen, zodat de membranen strak gespannen staan. Snijd het embryo met een micro-mes zo recht mogelijk door het gebied van belang. Voor het ruggenmerg moeten de coupes een dikte van één tot twee somieten hebben; bevestig de bladcoupes aan het laterale weefsel van het embryo zodat ze niet verloren gaan terwijl andere embryo's worden gesneden.

Er is een aangepaste micro-perpet-tip nodig om de dwarsdoorsneden van het ruggenmerg over te brengen naar de glazen bodemschaal. Bereid deze voor door een 200 µL tip op een P2 of P10 pipet te plaatsen en ongeveer 1 mm van het uiteinde van de tip af te knippen. Coat de binnenkant van de tip met collageen door 1 µL van het eerder bereide collagenmengsel aan te brengen.

Laat dit één tot twee minuten inwerken en spoel vervolgens met L 15-medium. Dit voorkomt dat het weefsel aan de binnenkant van de tip blijft kleven. Snijd nu met een micro-mes een plakje uit het embryo en verwijder het plakje uit de schaal met de P 2 of P 10, voorzien van de 200 µL tip.

Probeer zo min mogelijk medium op te nemen. Vortex het collagenmengsel en breng vijf tot acht microliters hiervan aan op een met poly-L-lysine gecoate glazen schaaltje met een dekglas als basis; plaats onmiddellijk de embryonale slice in het collageen en positioneer deze met een fijne pincet. De LIC's moeten zo worden geplaatst dat de zijde die wordt afgebeeld vlak tegen het dekglas aanligt.

Het weefsel moet hechten aan de poly-L-lysine coating op het dekglas. Herhaal dit totdat er meerdere coupes op het dekglas liggen. Gewoonlijk worden er zes tot negen coupes op één schaaltje geplaatst.

Wanneer alle coupes op hun plaats liggen, voegt u twee tot drie microliters L 15-medium toe aan de plek van het eerste collageen en sluit u de schaal. Laat het collageen 20 minuten uitharden. Zodra het collageen is uitgehard, voegt u voorzichtig twee milliliters coupeskweekmedium toe dat gedurende ten minste een uur is geëquilibreerd bij 5% koolstofdioxide en 37 °C.

Er moet zorgvuldig worden gewerkt om te voorkomen dat het collageen van het dekglas loslaat; plaats het geheel in een incubator op 37 °C met 5% CO2 en laat de coupes minstens drie uur herstellen voordat de beeldvorming plaatsvindt. Het over een langere periode in beeld brengen van celgedrag binnen weefsel met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie is uitdagend. Een combinatie van optimale kweekcondities en het gebruik van witveldmicroscopie is essentieel voor het verkrijgen van goede resultaten.

Een delta vision core wide field microscoop, uitgerust met een weather station environmental chamber, wordt gebruikt voor het beelden van de coupes. De kamer wordt constant op 37 °C gehouden met een koolstofdioxide-perfusieapparaat om de microscooptafel op 5% CO2 en 95% lucht te houden. Beeldvorming vindt gewoonlijk plaats met een 40× 1,30 NA olie-immersieobjectief en beelden worden vastgelegd met een core snap HQ two gekoelde CCD-camera. Z-secties worden vastgelegd elke 1,5 µm over een weefselexpositie van 45 µm. De belichtingstijd moet zo laag mogelijk worden gehouden, bijvoorbeeld tussen 5 en 50 milliseconden.

Voor elke genoemde sectie worden elke zeven minuten beelden vastgelegd. Met de Delta vision-systemen kunnen tot negen coupes worden bezocht. De hier getoonde nauwkeurige punt-bezoekfunctie is een voorbeeld van een time-lapse-sequentie van een ruggenmerg-progenitorcel die is getransfecteerd met een construct dat GFP alpha Tubulin tot expressie brengt; de beeldvorming is gestart op een ruggenmergcoupe van een twee dagen oud HH-stadium 12 embryo.

Tijdens deze vroege fase ondergaan neurale progenitorcellen voornamelijk delingen in de progenitor-progenitor modus, waarbij de cellen delen om twee verdere cyclus-doorlopende progenitorcellen te genereren. Deze figuur toont geselecteerde frames uit de zojuist getoonde time-lapse sequentie. Na twee uur en 20 minuten deelt de cel zich met een delingsvlak dat loodrecht op het apicale oppervlak staat, waarbij twee dochtercellen ontstaan.

Deze twee cellen delen zich opnieuw na 24 uur en 23 minuten en na 25 uur en 54 minuten. Deze volgende time-lapse-sequentie is van een cel getransfecteerd met G-F-P-G-P-I dat het celmembraan markeert. Deze cel ondergaat een deling waarbij het basale uitstulping in tweeën splitst, zoals aangegeven door de witte pijlen, en gelijkmatig wordt overgeërfd door de dochtercellen.

Geselecteerde frames uit deze time-lapse-sequentie laten zien dat de celdeling plaatsvindt op nul uur en 49 minuten. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u ruggenmergplakjes voorbereidt en afbeeldt. Houd er rekening mee dat u, indien u nieuw bent met deze techniek, in het begin mogelijk problemen ondervindt, aangezien er een aantal technisch uitdagende stappen zijn die allemaal moeten samenkomen om dit te laten slagen.