Confocale laserscanning microscopie-gebaseerde kwantitatieve analyse van Aspergillus fumigatus Conidia distributie in whole-mount optisch gewiste muislong

Onze aanpak stelt ons in staat om de kwantitatieve analyse uit te voeren van een Aspergillus fumigatus Conidia-verdeling in de optisch ontruimde muislong in zijn geheel. Aspergillus fumigatus Conidia kan de luchtwegen binnendringen en levensbedreigende ziekten veroorzaken bij immuungecompromitteerde patiënten. De luchtwegen van zoogdieren is een systeem van luchtwegen van verschillende generaties.

Elke generatie wordt gekenmerkt door de verschillende structuren van luchtwegwanden en immuuncelpopulaties. In de bronchiale takken, aspergillus fumigatus Conidia worden geëlimineerd door mucociliaire klaring. In de beschikbare ruimte werkt de mucociliaire klaring echter niet en moet Conidia worden gewist door de immuuncellen, zoals alveolaire macrofagen en neutrofielen.

Net als de ruimtelijke temporele aspecten van Conidia-verdeling in de luchtwegen zijn belangrijk. Echter, niet goed onderzocht vraag in het begrip van de ziekte mechanismen. Hier presenteren we een experimentele opstelling voor de kwantitatieve analyse van Aspergillus fumigatus Conidia distributie in de luchtwegen van geïnfecteerde muizen.

Ik breng 50 microliter aspergillus fumigatus Conidia aan op de muis. Zes uur later, oogst de long. Bevestig 's nachts in 2%formaldehyde en vlek met gelabeld Streptavidin conjugaat.

Onderwerp het monster vervolgens aan de optische opruiming. Plaats het monster in de glazen fles gevuld met 50% methanol wateroplossing en plaats het een uur op kamertemperatuur op de monstermixer. Vervang 50% methanol door 100% methanol en zet het twee uur onder de monstermixer.

Bereid een mengsel bestaande uit één deel benzylalcohol en twee delen benzylbenzoaat. Breng het monster er 24 putplaat op over en bedek het met het benzyl-benzoaatmengsel gedurende ten minste 30 minuten. Het monster is klaar voor beeldvorming.

Leg het monster op de monsterhouder. En plaats de houder in de microscoop. Nadat u het microscoopsysteem hebt ingeschakeld en de software hebt geopend, schakelt u het zendlampje in en selecteert u een X-objectief.

Zoek uw monster visueel in het zendlampje en ga verder met het tabblad acquisitie. Selecteer confocale lasermicroscopie Lambda-modus. Schakel de juiste lasers in.

Stel het spectrale bereik van de detector in en selecteer de dichroïsche spiegel. Stel de detectorversterking in en vernauw het pinhole tot één gebiedseenheid. Stel de pixelresolutie in op 512 bij 512.

Schakel de zed-stack-modus in en start live imaging. Zoek het brandpuntsvlak waar beide dobbelstenen zichtbaar zijn. Vouw het deelvenster zed-stack uit.

Zoek en selecteer met behulp van het scherpstelwiel de laagste en hoogste vlakken van het monster. Plaats het brandpuntsvlak naast de onderkant van het monster. Schakel de zed-stack-modus uit en kies de scanmodus in.

Pas indien nodig de X-, Y-positie en het aantal tegels aan. Schakel de zed-stack- en dialscanmodi in. Stel de zed-sectioning stap in op vijf micron.

Stel de scansnelheid in. Start het experiment. Beeldvorming duurt meestal enkele uren, afhankelijk van de landgrootte en de scansnelheid.

Het verkregen beeld wordt vervolgens spectraal ongemengd. Gebruik voor spectrale ontmenging de lineaire ontmengingsoptie. Selecteer de regio's die overeenkomen met de landgebieden met streptavidin en Conidia.

Begin met mengen. Sla na het uitpakken het ongemengde bestand op. Als u tegels uit de verkregen afbeelding wilt stichen, opent u de afbeelding.

Selecteer methoden, geometrische stiksels. Selecteer de afbeelding in het invoervenster. Selecteer in stikopties de optie nieuwe uitvoer- en zekeringstegels.

Gebruik de referentiemodus met een geselecteerd kanaal dat overeenkomt met de fluorescentie van de luchtwegen. Open de afbeelding in een overtollige 3D-weergave. Wijzig indien nodig de kleuren die worden gebruikt voor hun presentatie.

Hier tonen we airways kanaal in grijze tinten en Conidia kanaal in paars. Als u een luchtwegmasker wilt maken, gebruikt u een nieuw oppervlakgereedschap toevoegen. Selecteer het luchtwegkanaal en kies de afvlakparameter van 10 micron.

Verschillende filters kunnen worden gebruikt om het luchtwegsignaal uit te sluiten. Inspecteer eerst het oppervlak visueel en stel de intensiteitsdrempel in. Extra filters, zoals oppervlakte kunnen ook worden toegepast op uitsluitend geselecteerde luchtwegen, maar niet op pleura of bloedvaten.

Verwijder vervolgens handmatig het geselecteerde oppervlakfragment dat niet tot de luchtwegen behoort. Nu kunt u het gemaakte oppervlak observeren en de ontbrekende onderdelen onderzoeken om ze later te corrigeren. Maak een masker voor het luchtwegoppervlak met behulp van opties om alles te bewerken en te maskeren.

Selecteer het luchtwegkanaal en stel werkcellen buiten het oppervlak in op 0,001. Hier toonden we het resulterende masker in oranje. Sla conidia kanaal en de luchtweg masker in twee afzonderlijke mappen, als T van F serie.

Open het bestand met de afbeelding van het luchtwegmasker. Maak de afbeelding binair. Volg proces binair, maak binair.

Om op de dikte van het masker te lijken, past u verschillende verwijdings-3D-functies toe. Volg plug-ins, verwerk, verwijd 3D. U kunt hiervoor ook macrofunctionaliteit gebruiken.

Gebruik na verschillende cycli van dilaatproces de vulgatenfunctie. Volg proces, binair, vul gaten. Als u de resterende gaten in het masker handmatig wilt vullen, opent u de regio van de interessemanager.

volg analyse, tools, ROI manager. Selecteer met het gereedschap Polygoonselectie een gebied dat bij een bepaalde projectie moet worden gevuld. Doe dit meerdere keren voor weinig projecties in zed-stack, zodat u vormen van de gewenste regio's kunt interpoleren.

Als u de geselecteerde vormen wilt interpoleren, selecteert u ze allemaal en drukt u op meer, interpoleer U ROIs. Vul vervolgens alle ROIs met wit. Gebruik de vulgatenprocedure nogmaals.

Om de maskerdikte weer in elkaar te zetten na het vullen van de gaten, past u de erodeerfunctie 3D toe. Volg plug-ins, verwerk, eroder 3D. Je kunt hiervoor ook micro's gebruiken.

Het aantal iteraties in eroderen 3D en LA 3D moet gelijk zijn. Start de Conidia count applicatie. Druk op de knop Bestanden toevoegen en selecteer de mappen met DIFF-bestanden met het voorbereide luchtwegmasker en de Conidia-fluorescentieafbeeldingen.

Stel een aangepaste drempel tussen nul en één in. Druk op OK en bekijk de resultaten. Met behulp van deze aanpak voeren we zes uur na conidia-toediening de kwantitatieve analyse uit van de Conidia binnen en buiten de bronchiale boom van muizen.

De gegevens suggereren dat bij onze oorspronkelijke toepassing, de meerderheid van Conidia de alveola-ruimte penetreert en daar aan het begin van de inflammatoire immuunrespons wordt toegewezen. Driedimensionale beeldvorming van de muislongen met confocale laserscanmicroscopie maakt identificatie van Aspergillus fumigatus Conidia in de luchtwegen mogelijk. Verwerking van driedimensionale beelden met behulp van dit protocol maakt het mogelijk om kwantitatieve analyse uit te voeren van Conidia-distributie binnen en buiten de bronchiale takken.

Onze aanpak kan ook worden gebruikt om de kinetiek van de Conidia-eliminatie uit de uitjes van muizen te schatten en om anatomische Conidia-distributie in de immunocompetente en immunocompromitteerde muizen te vergelijken. Bovendien kan men met behulp van deze benadering de verdeling van de microdeeltjes of nanodeeltjes agglomeraten in de luchtwegen analyseren.