Confocale laserscanning microscopie-gebaseerde kwantitatieve analyse van Aspergillus fumigatus Conidia distributie in whole-mount optisch gewiste muislong
18 september 2021
We beschrijven de methode voor kwantitatieve analyse van de verdeling van Aspergillus fumigatus conidia (3 μm groot) in de luchtwegen van muizen. De methode kan ook worden gebruikt voor de analyse van microdeeltjes en nanodeeltjes agglomeraat distributie in de luchtwegen in verschillende pathologische conditiemodellen.
Onze aanpak stelt ons in staat om de kwantitatieve analyse uit te voeren van een Aspergillus fumigatus Conidia-verdeling in de optisch ontruimde muislong in zijn geheel. Aspergillus fumigatus Conidia kan de luchtwegen binnendringen en levensbedreigende ziekten veroorzaken bij immuungecompromitteerde patiënten. De luchtwegen van zoogdieren is een systeem van luchtwegen van verschillende generaties.
Elke generatie wordt gekenmerkt door de verschillende structuren van luchtwegwanden en immuuncelpopulaties. In de bronchiale takken, aspergillus fumigatus Conidia worden geëlimineerd door mucociliaire klaring. In de beschikbare ruimte werkt de mucociliaire klaring echter niet en moet Conidia worden gewist door de immuuncellen, zoals alveolaire macrofagen en neutrofielen.
Net als de ruimtelijke temporele aspecten van Conidia-verdeling in de luchtwegen zijn belangrijk. Echter, niet goed onderzocht vraag in het begrip van de ziekte mechanismen. Hier presenteren we een experimentele opstelling voor de kwantitatieve analyse van Aspergillus fumigatus Conidia distributie in de luchtwegen van geïnfecteerde muizen.
Ik breng 50 microliter aspergillus fumigatus Conidia aan op de muis. Zes uur later, oogst de long. Bevestig 's nachts in 2%formaldehyde en vlek met gelabeld Streptavidin conjugaat.
Onderwerp het monster vervolgens aan de optische opruiming. Plaats het monster in de glazen fles gevuld met 50% methanol wateroplossing en plaats het een uur op kamertemperatuur op de monstermixer. Vervang 50% methanol door 100% methanol en zet het twee uur onder de monstermixer.
Bereid een mengsel bestaande uit één deel benzylalcohol en twee delen benzylbenzoaat. Breng het monster er 24 putplaat op over en bedek het met het benzyl-benzoaatmengsel gedurende ten minste 30 minuten. Het monster is klaar voor beeldvorming.
Leg het monster op de monsterhouder. En plaats de houder in de microscoop. Nadat u het microscoopsysteem hebt ingeschakeld en de software hebt geopend, schakelt u het zendlampje in en selecteert u een X-objectief.
Zoek uw monster visueel in het zendlampje en ga verder met het tabblad acquisitie. Selecteer confocale lasermicroscopie Lambda-modus. Schakel de juiste lasers in.
Stel het spectrale bereik van de detector in en selecteer de dichroïsche spiegel. Stel de detectorversterking in en vernauw het pinhole tot één gebiedseenheid. Stel de pixelresolutie in op 512 bij 512.
Schakel de zed-stack-modus in en start live imaging. Zoek het brandpuntsvlak waar beide dobbelstenen zichtbaar zijn. Vouw het deelvenster zed-stack uit.
Zoek en selecteer met behulp van het scherpstelwiel de laagste en hoogste vlakken van het monster. Plaats het brandpuntsvlak naast de onderkant van het monster. Schakel de zed-stack-modus uit en kies de scanmodus in.
Pas indien nodig de X-, Y-positie en het aantal tegels aan. Schakel de zed-stack- en dialscanmodi in. Stel de zed-sectioning stap in op vijf micron.
Stel de scansnelheid in. Start het experiment. Beeldvorming duurt meestal enkele uren, afhankelijk van de landgrootte en de scansnelheid.
Het verkregen beeld wordt vervolgens spectraal ongemengd. Gebruik voor spectrale ontmenging de lineaire ontmengingsoptie. Selecteer de regio's die overeenkomen met de landgebieden met streptavidin en Conidia.
Begin met mengen. Sla na het uitpakken het ongemengde bestand op. Als u tegels uit de verkregen afbeelding wilt stichen, opent u de afbeelding.
Selecteer methoden, geometrische stiksels. Selecteer de afbeelding in het invoervenster. Selecteer in stikopties de optie nieuwe uitvoer- en zekeringstegels.
Gebruik de referentiemodus met een geselecteerd kanaal dat overeenkomt met de fluorescentie van de luchtwegen. Open de afbeelding in een overtollige 3D-weergave. Wijzig indien nodig de kleuren die worden gebruikt voor hun presentatie.
Hier tonen we airways kanaal in grijze tinten en Conidia kanaal in paars. Als u een luchtwegmasker wilt maken, gebruikt u een nieuw oppervlakgereedschap toevoegen. Selecteer het luchtwegkanaal en kies de afvlakparameter van 10 micron.
Verschillende filters kunnen worden gebruikt om het luchtwegsignaal uit te sluiten. Inspecteer eerst het oppervlak visueel en stel de intensiteitsdrempel in. Extra filters, zoals oppervlakte kunnen ook worden toegepast op uitsluitend geselecteerde luchtwegen, maar niet op pleura of bloedvaten.
Verwijder vervolgens handmatig het geselecteerde oppervlakfragment dat niet tot de luchtwegen behoort. Nu kunt u het gemaakte oppervlak observeren en de ontbrekende onderdelen onderzoeken om ze later te corrigeren. Maak een masker voor het luchtwegoppervlak met behulp van opties om alles te bewerken en te maskeren.
Selecteer het luchtwegkanaal en stel werkcellen buiten het oppervlak in op 0,001. Hier toonden we het resulterende masker in oranje. Sla conidia kanaal en de luchtweg masker in twee afzonderlijke mappen, als T van F serie.
Open het bestand met de afbeelding van het luchtwegmasker. Maak de afbeelding binair. Volg proces binair, maak binair.
Om op de dikte van het masker te lijken, past u verschillende verwijdings-3D-functies toe. Volg plug-ins, verwerk, verwijd 3D. U kunt hiervoor ook macrofunctionaliteit gebruiken.
Gebruik na verschillende cycli van dilaatproces de vulgatenfunctie. Volg proces, binair, vul gaten. Als u de resterende gaten in het masker handmatig wilt vullen, opent u de regio van de interessemanager.
volg analyse, tools, ROI manager. Selecteer met het gereedschap Polygoonselectie een gebied dat bij een bepaalde projectie moet worden gevuld. Doe dit meerdere keren voor weinig projecties in zed-stack, zodat u vormen van de gewenste regio's kunt interpoleren.
Als u de geselecteerde vormen wilt interpoleren, selecteert u ze allemaal en drukt u op meer, interpoleer U ROIs. Vul vervolgens alle ROIs met wit. Gebruik de vulgatenprocedure nogmaals.
Om de maskerdikte weer in elkaar te zetten na het vullen van de gaten, past u de erodeerfunctie 3D toe. Volg plug-ins, verwerk, eroder 3D. Je kunt hiervoor ook micro's gebruiken.
Het aantal iteraties in eroderen 3D en LA 3D moet gelijk zijn. Start de Conidia count applicatie. Druk op de knop Bestanden toevoegen en selecteer de mappen met DIFF-bestanden met het voorbereide luchtwegmasker en de Conidia-fluorescentieafbeeldingen.
Stel een aangepaste drempel tussen nul en één in. Druk op OK en bekijk de resultaten. Met behulp van deze aanpak voeren we zes uur na conidia-toediening de kwantitatieve analyse uit van de Conidia binnen en buiten de bronchiale boom van muizen.
De gegevens suggereren dat bij onze oorspronkelijke toepassing, de meerderheid van Conidia de alveola-ruimte penetreert en daar aan het begin van de inflammatoire immuunrespons wordt toegewezen. Driedimensionale beeldvorming van de muislongen met confocale laserscanmicroscopie maakt identificatie van Aspergillus fumigatus Conidia in de luchtwegen mogelijk. Verwerking van driedimensionale beelden met behulp van dit protocol maakt het mogelijk om kwantitatieve analyse uit te voeren van Conidia-distributie binnen en buiten de bronchiale takken.
Onze aanpak kan ook worden gebruikt om de kinetiek van de Conidia-eliminatie uit de uitjes van muizen te schatten en om anatomische Conidia-distributie in de immunocompetente en immunocompromitteerde muizen te vergelijken. Bovendien kan men met behulp van deze benadering de verdeling van de microdeeltjes of nanodeeltjes agglomeraten in de luchtwegen analyseren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor de kwantitatieve analyse van de verdeling van Aspergillus fumigatus conidia in de luchtwegen van muizen. De techniek kan ook worden toegepast om de verdeling van microdeeltjes en nanodeeltje-agglomeraten in verschillende pathologische toestanden te analyseren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Microbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Aspergillus fumigatus kan ernstige luchtwegaandoeningen veroorzaken, vooral bij immuungecompromitteerde individuen.
- De luchtwegen bestaan uit luchtwegen met verschillende structuren en immuuncelpopulaties.
- Mucociliaire klaring is het primaire verdedigingsmechanisme tegen ingeademde conidia.
- In bepaalde regio's spelen immuuncellen zoals alveolaire macrofagen en neutrofielen een cruciale rol bij het verwijderen van conidia.
Doel van het onderzoek
- Om een kwantitatieve methode te ontwikkelen voor het analyseren van de verdeling van Aspergillus fumigatus conidia in muizenlongen.
- Om het begrip van conidia-gedrag in het ademhalingssysteem te verbeteren.
- Om inzichten te bieden in de immuunrespons tegen ingeademde pathogenen.
Gebruikte methoden
- Optische klaring van hele muizenlongen.
- Kwantitatieve analyse van conidia-verdeling.
- Beoordeling van luchtwegstructuren en interacties met immuuncellen.
- Toepassing van de methode op microdeeltjes en nanodeeltje-agglomeraten.
Belangrijkste resultaten
- De methode visualiseert en kwantificeert effectief de verdeling van conidia in de luchtwegen.
- Bevindingen benadrukken de rol van immuuncellen bij het verwijderen van conidia uit de luchtwegen.
- De techniek kan worden aangepast voor het bestuderen van andere deeltjes in pathologische modellen.
- Resultaten dragen bij aan het begrip van de dynamiek van luchtweginfecties.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van schimmelinfecties in het ademhalingssysteem.
- De verkregen inzichten kunnen therapeutische strategieën voor risicopopulaties informeren.
- Toekomstig onderzoek kan deze methodologie uitbreiden voor bredere toepassingen in de gezondheid van de luchtwegen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables quantitative spatial analysis of pathogen distribution in whole-mount cleared tissues, supporting mechanistic de-risking in antifungal target validation. By providing 3D localization and kinetic data on conidia clearance, it informs predictive confidence in preclinical models of immunocompromised host defense. The approach enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation of host-directed or pathogen-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying conidia localization in bronchial versus alveolar compartments.
- Scientific Value: Supports functional target validation by identifying spatial patterns of immune cell-pathogen interaction.
- Operational Value: Provides reproducible 3D imaging workflow for de-risking mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of conidia burden inside and outside bronchial trees for assay standardization.
- Operational Value: Enables scalable, multiplex-compatible imaging of fluorescently labeled pathogens in cleared whole organs.
- Operational Value: Facilitates assay reproducibility through standardized optical clearing, staining, and spectral unmixing steps.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links early immune response dynamics to pathogen elimination kinetics in immunocompetent versus immunocompromised models.
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by correlating spatial conidia distribution with immune cell recruitment.
- Operational Value: Permits longitudinal tracking of conidia clearance to inform risk-adjusted advancement decisions in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling spatial hypothesis testing and pathway clarification in pulmonary infection models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of immune evasion mechanisms through quantitative 3D mapping of conidia distribution.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized tissue preparations with quantitative fluorescence readouts for compound or genotype screening.
- Analytics: Provides z-sectioned, spectrally unmixed 3D datasets enabling statistical comparison of conidia burden across experimental groups.
- Translational Research: Connects early innate immune responses to preclinical outcomes via spatial-temporal pathogen tracking.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for analyzing particulate distribution (e.g., microparticles, nanoparticles) in respiratory disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in antifungal target validation through direct visualization of pathogen-immune interactions.
- Operational Value: Standardizes whole-mount lung processing for reproducible, high-content 3D imaging across sites.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing spatially resolved efficacy data in immunocompromised host models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutics based on anatomical compartment-specific pathogen clearance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, optical clearing, and 3D image analysis workflows.
- Dependent on laser scanning microscopy with spectral unmixing and tiling capabilities for whole-lung imaging.
- Necessitates cross-team standardization of staining, clearing, and masking protocols for reproducible quantification.
- Adaptation to alternative model systems may require optimization of clearing duration and refractive index matching.
- Practical limitations include imaging time scaling with lung size and scanning speed, as noted in the source.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:03
Aspergillus fumigatus Conidia Application & Specimen Preparation
1:22
Mouse Lung Lobe Optical Clearing
2:23
Mouse Lung Lobe Imaging with CLSM
6:50
Image Processing: Surface Rendering
9:23
Image Processing: Mask Correction
12:54
Conidia Quantitative Analysis
13:41
Representative Results
14:07
Conclusions
