Name: Drie differentiële expressieanalysemethoden voor RNA-sequencing: limma, EdgeR, DESeq2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Leer differentiële expressieanalyse van RNA-sequencinggegevens met limma, EdgeR en DESeq2 in RStudio. Deze methoden vergelijken genexpressie in cholangiocarcinoom en identificeren gereguleerde genen voor bioinformatica-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81860276) en Key Special Fund Projects of National Key R&D Program (Grant No. 2018YFC1003200).

OPMERKING: Open het R-studio programma en laad R bestand "DEGs.R", het bestand kan worden verkregen uit aanvullende bestanden / scripts.
1. Downloaden en voorverwerking van gegevens
<ol><li>Download de HTSeq-count-gegevens (high-throughput sequencing) van cholangiocarcinoom (CHOL) uit The Cancer Genome Atlas (TCGA). Deze stap kan eenvoudig worden bereikt met de volgende R-code.<ol>
<li>Klik op Uitvoeren om R-pakketten te installeren.</li>
		<li>Klik op Uitvoeren om R-pakketten te laden. als(!requireNamespace("BiocManager", quiet=TRUE)) + install.packages("BiocManager") BiocManager::install(c("TCGAbiolinks", "SamengevatExperiment"))</li>
		<li>Stel de werkmap in. bibliotheek (TCGAbiolinks) bibliotheek(SamengevatExperiment) setwd("C:/Gebruikers/LIUSHIYI/Desktop")</li>
		<li>Kies het kankertype. kanker <- "TCGA-CHOL"</li>
		<li>Voer de R-code uit vanuit het bestand "GDCquery.R" om de gegevens te downloaden. Het bestand "GDCquery.R" kan worden verkregen uit aanvullende bestanden / scripts: bron("Aanvullende bestanden/Scripts/GDCquery.R") hoofd(cnt) ##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ##ENSG00000000003 4262 ##ENSG00000000005 1 ##ENSG00000000419 1254 ##ENSG00000000457 699 ##ENSG00000000460 239 ##ENSG00000000938 334 OPMERKING: Na uitvoering worden de CHOLHTSeq-tellingsgegevens gedownload en "cnt" genoemd, waarbij rijen ensemblegen-ID's vertegenwoordigen en kolommen voorbeeld-ID's vertegenwoordigen. Let op de nummers op de posities 14-15 in de monster-ID's; getallen variërend van 01 tot 09 wijzen op tumoren en variërend van 10 tot 19 wijzen op normale weefsels.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Converteer ensemblegen-ID's naar genrembolen.<ol>
<li>Importeer het annotatiebestand in R op basis van het opslagpad. Het annotatiebestand (gencode.v22.annotation.gtf) kan worden verkregen uit aanvullende bestanden. gtf_v22 <- rtracklayer::import('Aanvullende bestanden/gencode.v22.annotation.gtf')</li>
		<li>Voer de R-code uit vanuit de gtf_v22. R"-bestand, dat kan worden verkregen uit aanvullende bestanden/ scripts: bron("Aanvullende bestanden/Scripts/gtf_v22. R")</li>
		<li>Pas de functie "ann" toe om de ensemblegen-ID's om te zetten in genrembolen. cnt=ann(cnt,gtf_v22)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laag-uitgedrukte genen filteren<ol>
<li>Klik op Uitvoeren om het R-pakket "edgeR" te installeren. BiocManager::installeren("edgeR")</li>
		<li>Klik op Uitvoeren om het R-pakket "edgeR" te laden. bibliotheek(edgeR)</li>
		<li>Voer de volgende R-code uit om genen met een CPM-waarde (Counts Per Million) groter dan één op ten minste twee monsters te behouden. houd <-rowSums(cpm(cnt)>1)>=2 cnt <- as.matrix(cnt[houden,]) OPMERKING: De waarde tellingen per miljoen (CPM) wordt gebruikt in plaats van de leestelling om de afwijking veroorzaakt door verschillende sequencingdiepten te elimineren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Differentiële expressieanalyse door "limma"
<ol><li>Klik op Uitvoeren om het R-pakket "limma" te installeren. BiocManager::installeren("limma")</li>
	<li>Klik op Uitvoeren om de R-pakketten "limma", "edgeR" te laden. bibliotheek(limma) bibliotheek(edgeR)</li>
	<li>Voer de volgende R-code uit om de ontwerpmatrix te maken. groep <- substring(colnames(cnt),14,15) # Extract group information groep [groep %in% "01"] <- "Cancer" # set '01' as tumor tissue groep [groep %in% "11"] <- "Normal" # set '11' as normal tissue groep <- factor (group, levels = c("Normal","Cancer"))
	<ol><li>Maak de ontwerpmatrix. ontwerp <- model.matrix (~group) rijnamen(ontwerp) <- colnames(cnt)</li>
		<li>Maak het object DGEList. dge <- DGEList(tellingen = cnt, groep = groep)</li>
		<li>Normaliseer de gegevens. dge <- calcNormFactors(dge, methode = "TMM")</li>
		<li>Voer de volgende R-code uit om de op limma-trendmethode gebaseerde differentiële expressieanalyse uit te voeren. dge ##An object van klasse "DGEList" ##$counts ##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ##TSPAN6 4262 ##DPM1 1254 ##SCYL3 699 ##C1orf112 239 ##FGR 334</li>
		<li>Bereken de CPM-waarde. logdge <-cpm(dge, log=TRUE, prior.count=3)</li>
		<li>Klik op Uitvoeren om een lineair model te passen om de gegevens te voorspellen of de relatie tussen variabelen af te leiden. fit <- lmFit (logdge, ontwerp)</li>
		<li>Bereken de T-waarde, F-waarde en log-odds op basis van Bayesian. fit <- eBayes (fit, trend=WAAR)</li>
		<li>De resultaattabel extraheren. res_limma<- as.data.frame (topTabel(fit,n=Inf)) hoofd(res_limma) ## logFC AveExpr t P.Waarde adj. P.Val B ##RP11-252E2.2 -4.899493 -2.488589 -20.88052 2.386656e-25 4.931786e-21 47.28823 ##BX842568.1 -4.347930 -2.595205 -20.14532 1.082759e-24 1.118706e-20 45.83656 ##CTC-537E7.3 -5.154894 -2.143292 -19.59571 3.452354e-24 2.216114e-20 44.72001 ##RP11-468N14.3 -6.532259 -2.029714 -19.49409 4.289807e-24 2.216114e-20 44.51056 ##AP006216,5 -4,507051 -2,670915 -19,25649 7,153356e-24 2,956339e-20 44,01704 ##RP11-669E14.4 -4.107204 -2.828311 -18.93246 1.448209e-23 4.987633e-20 43.33543 #The resultaat van differentiële expressieanalyse wordt opgeslagen in "res_limma", waaronder de gen-id, log2 fold change value (logFC), het gemiddelde log2-expressieniveau van het gen in het experiment (AveExpr), de gewijzigde t-statistiek (t), relavent p-waarde (P.Value), de false discovery rate (FDR) gecorrigeerde p-waarde (adj. P.Val) en de log-odds van differentieel uitgedrukte genen (B) OPMERKING: De functie "calcNormFactors()" van de "edgeR" werd gebruikt om de gegevens te normaliseren om de invloed te elimineren die wordt veroorzaakt door monstervoorbereiding of bibliotheekconstructie en sequencing. Bij de constructie van de ontwerpmatrix is het noodzakelijk om experimenteel ontwerp (bijv. weefseltype: normaal of tumorweefsel) te matchen om ID's van de matrix te bemonsteren. limma-trend is geschikt voor gegevens waarvan de sequencingdiepte hetzelfde is, terwijl limma-voom geschikt is: (i) wanneer de grootte van de voorbeeldbibliotheek anders is; ii) gegevens die niet door TMM zijn genormaliseerd; (iii) er is veel "ruis" in de gegevens. Een positieve logFC betekent dat het gen in het experiment up-gereguleerd is, terwijl negatief getal betekent dat het gen down-gereguleerd is.</li>
		<li>Identificeer de DEG's. res_limma$sig <-as.factor( ifelse (res_limma$adj. P.Val < 0.05 & abs(res_limma$logFC) > 2, ifelse(res_limma$logFC > 2 ,'up','down'),'not')) # De adj.p Value < 0,05 en de |log2FC| >= 2 zijn drempels om de DEG's te identificeren samenvatting(res_limma$sig) ##down niet omhoog ##1880 ​17341 1443</li>
		<li>Voer de resultaattabel uit naar een bestand. schrijven.csv(res_limma, bestand = 'result_limma.csv')</li>
		<li>Klik op Uitvoeren om het R-pakket "ggplot2" te installeren. install.packages("ggplot2")</li>
		<li>Klik op Uitvoeren om het R-pakket "ggplot2" te laden. bibliotheek(ggplot2)</li>
		<li>Voer de R-code uit vanaf de vulkaan. R" om het vulkaanperceel te creëren. Het bestand "vulkaan. R" kan worden verkregen uit aanvullende bestanden. bron("Aanvullende bestanden/Scripts/volcano. R") vulkaan(res_limma,"logFC","adj. P.Val",2.0.05) OPMERKING: Genen kunnen worden toegewezen aan verschillende posities op basis van hun log2FC- en adj-p-waarden, de omhoog gereguleerde DEG's zijn rood gekleurd en de down-gereguleerde DEG's zijn groen gekleurd.</li>
		<li>Klik op Exporteren om het vulkaanplot op te slaan. OPMERKING: De vulkaanpercelen kunnen worden gegenereerd en gedownload in verschillende formaten (bijv. pdf, TIFF, PNG, JPEG-formaat). Genen kunnen worden toegewezen aan verschillende posities op basis van hun log2FC- en adj p-waarden, de up-regulated DEG's (log2FC > 2, adj p < 0,05) zijn rood gekleurd en de down-gereguleerde DEG's (log2FC < -2, adj p < 0,05) zijn groen gekleurd, niet-DEG's zijn grijs gekleurd.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Differentiële expressieanalyse door middel van "edgeR"
<ol><li>Klik op Uitvoeren om het R-pakket "edgeR" te laden. bibliotheek(edgeR)</li>
	<li>Voer de volgende R-code uit om een ontwerpmatrix te maken. groep <-substring(colnames(cnt),14,15) groep [groep %in% "01"] <- "Kanker" groep [groep %in% "11"] <- "Normaal" group=factor(groep, niveaus = c("Normaal","Kanker")) ontwerp <-model.matrix(~group) rijnamen(ontwerp) = colnames(cnt)</li>
	<li>Klik op Uitvoeren om het DGEList-object te maken. dge <- DGELijst(counts=cnt)</li>
	<li>Normaliseer de gegevens. dge <- calcNormFactors(dge, methode = "TMM")</li>
	<li>Klik op Uitvoeren om de spreiding van genexpressiewaarden te schatten. dge <- schattingDisp(dge, design, robuust = T)</li>
	<li>Klik op Uitvoeren om het model aan te passen om gegevens te tellen. fit <- glmQLFit(dge, ontwerp)</li>
	<li>Voer een statistische test uit. pasvorm <- glmQLFTest(fit)</li>
	<li>De resultaattabel extraheren. Het resultaat wordt opgeslagen in "res_edgeR", waaronder de wijzigingswaarde van de logvouwen, log CPM, F, p-waarde en FDR gecorrigeerde p-waarde. res_edgeR=as.data.frame(topTags(fit, n=Inf)) hoofd(res_edgeR) ## logFC logCPM F PValue FDR ##GCDH -3.299633 5.802700 458.5991 1.441773e-25 2.979280e-21 ##MSMO1 -3.761400 7.521111 407.0416 1.730539e-24 1.787993e-20R ##CL1 -3.829504 5.319641 376.5043 8.652474e-24 5.516791e-20 ##ADI1 -3.533664 8.211281 372.6671 1.067904e-23 5.516791e-20 ##KCNN2 -5.583794 3.504017 358.6525 2.342106e-23 9.679455e-20 ##GLUD1 -3.287447 8.738080 350.0344 3.848408e-23 1.194406e-19 #The resultaat wordt opgeslagen in "res_edgeR", waaronder de log fold change value (logFC), log CPM, F, p-waarde en FDR gecorrigeerde p-waarde</li>
	<li>Identificeer de DEG's. res_edgeR$sig = as.factor( ifelse (res_edgeR$FDR < 0.05 & abs(res_edgeR$logFC) > 2, ifelse(res_edgeR$logFC > 2 'up','down'),'not')) samenvatting(res_edgeR$sig) ##down niet omhoog ##1578 15965 3121</li>
	<li>Voer de resultaattabel uit naar een bestand. schrijven.csv(res_edgeR, bestand = 'res_edgeR.csv')</li>
	<li>Maak het vulkaanperceel. vulkaan (res_edgeR,"logFC","FDR",2,0.05)</li>
	<li>Klik op Exporteren om het vulkaanplot op te slaan.</li>
</ol>4. Differentiële expressieanalyse via "DESeq2"
<ol><li>Klik op Uitvoeren om R-pakketten "DESeq2" te installeren. BiocManager::installeren("DESeq2")</li>
	<li>Klik op Uitvoeren om R-pakketten "DESeq2" te laden. bibliotheek(DESeq2)</li>
	<li>Voer de volgende R-code uit om de groeperingsfactor te bepalen. groep <-substring(colnames(cnt),14,15) groep [groep %in% "01"] <- "Kanker" groep [groep %in% "11"] <- "Normaal" group=factor(groep, niveaus = c("Normaal","Kanker"))</li>
	<li>Maak het OBJECT DESeqDataSet. dds <-DESeqDataSetFromMatrix (cnt, DataFrame(groep), ontwerp = ~group) Dds ##class: DESeqDataSet ##dim: 20664 45 ##metadata(1): versie ##assays(1): telt ##rownames(20664): TSPAN6 DPM1 ... RP11-274B21.13 LINC01144 ##rowData namen(0): ##colnames(45): TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ... ##colData namen(1): groep</li>
	<li>Voer de analyse uit. dds <- DESeq(dds)</li>
	<li>Genereer de resultatentabel. res_DESeq2 <- data.frame(resultaten(dds)) hoofd(res_DESeq2) ## baseMean log2FoldChange lfcSE stat pvalue padj ##TSPAN6 4704.9243 -0.8204515 0.3371667 -2.433370 1.495899e-02 2.760180e-02 ##DPM1 1205.9087 -0.3692497 0.1202418 -3.070894 2.134191e-03 4.838281e-03 ##SCYL3 954.9772 0.2652530 0.2476441 1.071106 2.841218e-01 3.629059e-01 ##C1orf112 277.7756 0.7536911 0.2518929 2.992109 2.770575e-03 6.101584e-03 ##FGR 345.8789 -0.6423198 0.3712729 -1.730047 8.362180e-02 1.266833e-01 ##CFH 27982.3546 -3.8761382 0.5473363 -7.081823 1.422708e-12 1.673241e-11 OPMERKING: Het resultaat wordt opgeslagen in "res_DESeq2", dat het gemiddelde van het genormaliseerde aantal lees (baseMean), log fold Change value (log2FoldChange), log fold change standard error (lfcSE), de Wald-statistiek (stat), de oorspronkelijke p-waarde (pvalue) en de gecorrigeerde p-waarde (padj) omvat</li>
	<li>Identificeer DEG's. res_DESeq2$sig = as.factor( ifelse (res_DESeq2$padj < 0.05 & abs (res_DESeq2$log2FoldChange) > 2, ifelse(res_DESeq2$log2FoldChange > 2 'up','down'),'not')) samenvatting(res_DESeq2$sig) ##down niet omhoog ##1616 16110 2938</li>
	<li>Voer de resultaattabel uit naar een bestand. schrijven.csv(res_DESeq2, bestand = 'res_DESeq2.csv')</li>
	<li>Maak het vulkaanperceel. vulkaan (res_DESeq2,"log2FoldChange","padj",2,0.05)</li>
	<li>Klik op Exporteren om het vulkaanplot op te slaan.</li>
</ol>5. Venn diagram
<ol><li>Klik op Uitvoeren om het R-pakket "VennDiagram" te installeren. install.packages("VennDiagram")</li>
	<li>Klik op Uitvoeren om het R-pakket "VennDiagram" te laden. bibliotheek (VennDiagram)</li>
	<li>Maak een Venn-diagram van omhoog gereguleerde DEG's. grid.newpage() grid.draw(venn.diagram(list(Limma=rijnamen(res_ limma[res_limma$sig=="omhoog",]), edgeR=rownames(res_edgeR[res_edgeR$sig=="omhoog",]), DESeq2=rijnamen(res_DESeq2[res_DESeq2$sig== "omhoog",])), NULL,hoogte = 3,breedte = 3,eenheden = "in", col="zwart",lwd=0,3,fill=c("#FF6666","#FFFF00", "#993366"), alfa=c(0,5, 0,5, 0,5),main = "Up-regulated DEGs"))</li>
	<li>Klik op Exporteren om het Venn-diagram op te slaan.</li>
	<li>Maak een Venn-diagram van down gereguleerde DEG's. grid.newpage() grid.draw(venn.diagram(list(Limma=rijnamen(res_ limma[res_limma$sig=="omlaag",]), edgeR=rijnamen(res_edgeR[res_edgeR$sig== "omlaag",]), DESeq2=rijnamen(res_DESeq2[res_DESeq2$sig=="omlaag",])), NULL,hoogte = 3,breedte = 3,eenheden = "in", col="zwart",lwd=0,3,fill=c("#FF6666","#FFFF00", "#993366"), alfa=c(0,5, 0,5, 0,5),main = "Down-regulated DEGs"))</li>
	<li>Klik op Exporteren om het Venn-diagram op te slaan.</li>
</ol>

<ol><li>Tambonis, T., Boareto, M., Leite, V. B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Expression+Analysis+in+RNA-seq+Data+Using+a+Geometric+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential Expression Analysis in RNA-seq Data Using a Geometric Approach.</a> Journal of Computational Biology. 25, 1257-1265 (2018).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Anders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Count-based+differential+expression+analysis+of+RNA+sequencing+data+using+R+and+Bioconductor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Count-based differential expression analysis of RNA sequencing data using R and Bioconductor.</a> Nature Protocols. 8, 1765-1786 (2013).</li>
<li>McDermaid, A., Monier, B., Zhao, J., Liu, B., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+differential+gene+expression+results+of+RNA-seq+data%3A+review+and+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Interpretation of differential gene expression results of RNA-seq data: review and integration.</a> Briefings in Bioinformatics. 20, 2044-2054 (2019).</li>
<li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+differential+expression+analysis%3A+An+extended+review+and+a+software+tool%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12, 0190152(2017).</li>
<li>Law, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+analysis+is+easy+as+1-2-3+with+limma%2C+Glimma+and+edgeR%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">RNA-seq analysis is easy as 1-2-3 with limma, Glimma and edgeR.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
<li>Varet, H., Brillet-Guéguen, L., Coppée, J. Y., Dillies, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARTools%3A+A+DESeq2-+and+EdgeR-Based+R+Pipeline+for+Comprehensive+Differential+Analysis+of+RNA-Seq+Data%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SARTools: A DESeq2- and EdgeR-Based R Pipeline for Comprehensive Differential Analysis of RNA-Seq Data.</a> PloS One. 11, 0157022(2016).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43, 47(2015).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26, Oxford, England. 139-140 (2010).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15, 550(2014).</li>
<li>Gentleman, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconductor%3A+open+software+development+for+computational+biology+and+bioinformatics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics.</a> Genome Biology. 5, 80(2004).</li>
<li>Law, C. W., Chen, Y., Shi, W., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((voom%3A+Precision+weights+unlock+linear+model+analysis+tools+for+RNA-seq+read+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">voom: Precision weights unlock linear model analysis tools for RNA-seq read counts.</a> Genome Biology. 15, 29(2014).</li>
<li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+models+and+empirical+bayes+methods+for+assessing+differential+expression+in+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Statistical+Applications+in+Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 3, (2004).</li>
<li>Lund, S. P., Nettleton, D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+differential+expression+in+RNA-sequence+data+using+quasi-likelihood+with+shrunken+dispersion+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Statistical+Applications+in+Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detecting differential expression in RNA-sequence data using quasi-likelihood with shrunken dispersion estimates.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 11, (2012).</li>
<li>Reeb, P. D., Steibel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+statistical+analysis+models+for+RNA+sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evaluating statistical analysis models for RNA sequencing experiments.</a> Frontiers in Genetics. 4, 178(2013).</li>
<li>Rocke, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+False+Positive+Rates+in+Methods+for+Differential+Gene+Expression+Analysis+using+RNA-Seq+Data%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Excess False Positive Rates in Methods for Differential Gene Expression Analysis using RNA-Seq Data.</a> bioRxiv. , (2015).</li>
<li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+calibration+of+transcriptome+data+from+RNA-Seq+and+tiling+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison and calibration of transcriptome data from RNA-Seq and tiling arrays.</a> BMC genomics. 11, 383(2010).</li>
<li>Leng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBSeq%3A+an+empirical+Bayes+hierarchical+model+for+inference+in+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">EBSeq: an empirical Bayes hierarchical model for inference in RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 29, Oxford, England. 1035-1043 (2013).</li>
</ol>

Het manuscript is nog niet eerder gepubliceerd en wordt niet elders gepubliceerd. Alle auteurs hebben bijgedragen aan de creatie van dit manuscript voor belangrijke intellectuele inhoud en hebben het uiteindelijke manuscript gelezen en goedgekeurd. Wij verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Overvloedige afwijkende transcripties bij kankers kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door RNA-seq differentiële analyse5. De toepassing van RNA-seq differentiële expressieanalyse is echter vaak beperkt omdat het bepaalde vaardigheden met R-taal vereist en het vermogen om geschikte methoden te kiezen. Om dit probleem aan te pakken, bieden we een gedetailleerde inleiding tot de drie meest bekende methoden (limma, EdgeR en DESeq2) en zelfstudies voor het toepassen van de RNA-seq differentiële ...

RNA-sequencing (RNA-seq) is een van de meest gebruikte technologieën in transcriptomics met veel voordelen (bijv. hoge reproduceerbaarheid van gegevens) en heeft ons begrip van de functies en dynamiek van complexe biologische processen drastisch vergroot1,2. Identificatie van aberraattranscripties onder verschillende biologische context, die ook bekend staan als differentieel uitgedrukte genen (DEG's), is een belangrijke stap in de RNA-seq-analyse. RNA-seq maakt het mogelijk om een diepgaand begrip te krijgen van pathogenese gerelateerde moleculaire mechanismen en biologische functies. Daarom is differentiële analyse als waardevol beschouwd voor diagnostiek, prognose en therapieën van tumoren3,4,5. Momenteel zijn er meer open-source R/Bioconductor-pakketten ontwikkeld voor RNA-seq differentiële expressieanalyse, met name limma, DESeq2 en EdgeR1,6,7. Differentiële analyse vereist echter bepaalde vaardigheden met R-taal en het vermogen om de juiste methode te kiezen, die ontbreekt in het curriculum van medisch onderwijs.
In dit protocol, gebaseerd op de cholangiocarcinoom (CHOL) RNA-seq telling gegevens geëxtraheerd uit The Cancer Genome Atlas (TCGA), drie van de meest bekende methoden (limma8, EdgeR9 en DESeq210) werden uitgevoerd, respectievelijk, door het R-programma11 om de DEG's tussen CHOL en normale weefsels te identificeren. De drie protocollen van limma, EdgeR en DESeq2 zijn vergelijkbaar, maar hebben verschillende stappen tussen de processen van de analyse. De genormaliseerde RNA-seq-tellingsgegevens zijn bijvoorbeeld nodig voor EdgeR en limma8,9, terwijl DESeq2 zijn eigen bibliotheekverschillen gebruikt om gegevens te corrigeren in plaats van normaliseren10. Verder is edgeR specifiek geschikt voor RNA-seq data, terwijl de limma wordt gebruikt voor microarrays en RNA-seq. Limma keurt een lineair model goed om de DEG 's12te beoordelen , terwijl de statistieken in edgeR zijn gebaseerd op de negatieve binomiale verdelingen, waaronder empirische Bayes-schatting, exacte tests, gealdaliseerde lineaire modellen en quasi-waarschijnlijkheidstests9.
Samengevat bieden we de gedetailleerde protocollen van RNA-seq differentiële expressieanalyse met behulp van respectievelijk limma, DESeq2 en EdgeR. Door naar dit artikel te verwijzen, kunnen gebruikers eenvoudig de RNA-seq differentiële analyse uitvoeren en de juiste differentiële analysemethoden voor hun gegevens kiezen.

<table><tbody><tr><td>R</td><td></td><td>versie 3.6.2</td><td>gratis software</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td></td><td></td><td>gratis software</td></tr></tbody></table>

drie differentiële expressieanalysemethoden voor rna-sequencing: limma, edger, deseq2

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

RNA-sequencing (RNA-seq) is een van de meest gebruikte technologieën in transcriptomics omdat het de relatie tussen de genetische verandering en complexe biologische processen kan onthullen en grote waarde heeft in diagnostiek, prognose en therapieën van tumoren. Differentiële analyse van RNA-seq-gegevens is cruciaal om afwijkende transcripties te identificeren, en limma, EdgeR en DESeq2 zijn efficiënte tools voor differentiële analyse. RNA-seq differentiële analyse vereist echter bepaalde vaardigheden met R-taal en het vermogen om een geschikte methode te kiezen, die ontbreekt in het curriculum van medisch onderwijs.
Hierin bieden we het gedetailleerde protocol om differentieel uitgedrukte genen (DEG's) tussen cholangiocarcinoom (CHOL) en normale weefsels te identificeren via respectievelijk limma, DESeq2 en EdgeR, en de resultaten worden weergegeven in vulkaanpercelen en Venn-diagrammen. De drie protocollen van limma, DESeq2 en EdgeR zijn vergelijkbaar, maar hebben verschillende stappen tussen de processen van de analyse. Een lineair model wordt bijvoorbeeld gebruikt voor statistieken in limma, terwijl de negatieve binomiale verdeling wordt gebruikt in edgeR en DESeq2. Bovendien zijn de genormaliseerde RNA-seq-tellingsgegevens noodzakelijk voor EdgeR en limma, maar niet nodig voor DESeq2.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor drie differentiële analysemethoden: limma, EdgeR en DESeq2. De resultaten van de drie methoden overlappen elkaar gedeeltelijk. Alle drie de methoden hebben hun eigen voordelen en de keuze van de methode hangt alleen af van de gegevens.

Er zijn verschillende benaderingen om het resultaat van differentiële expressieanalyse te visualiseren, waaronder het vulkaanplot en venndiagram in het bijzonder worden gebruikt. limma identificeerde 3323 DEG's tussen de CHOL en normale weefsels met de |logFC|≥2 en adj. P.Val <0,05 als drempels, waaronder 1880 in CHOL-weefsels en 1443 in CHOL-weefsels werden gereguleerd (figuur 1a). Ondertussen identificeerde edgeR de 1578 down-gereguleerde DEG's en 3121 up-regulated DEG's (<strong class="xf...

Een gedetailleerd protocol van differentiële expressie analysemethoden voor RNA-sequencing werd verstrekt: limma, EdgeR, DESeq2.

Drie differentiële expressieanalysemethoden voor RNA-sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...

Drie differentiële expressieanalysemethoden voor RNA-sequencing: limma, EdgeR en DESeq2. Open het RStudio-programma en laad vervolgens het R-bestand, DEGs. Het bestand kan worden verkregen uit aanvullende bestanden. Een.Downloaden en voorverwerking van gegevens.1.1. Download de gegevens over het aantal sequencings met hoge doorvoer van Cholangiocarcinoom uit de Kankergenoomatlas. Dit tabblad kan gemakkelijk worden bereikt door de volgende code.Klik op uitvoeren om het R-pakket te installeren. Klik op uitvoeren om het R-pakket te laden. Werkmap instellen.Kies het kankertype. Voer R-code uit het GDCquery-bestand uit om de gegevens te downloaden. Bestand GDCquery kan worden verkregen uit aanvullende bestanden / scripts.Na uitvoering kunnen de Cholangiocarcinoom RNA-sequencing-tellingsgegevens worden gedownload en CNT worden genoemd, waarbij rijen ensemblegen-ID's vertegenwoordigen en kolommen symbolen-ID's vertegenwoordigen. Let op de nummers op positie 14 t/m 15 in de symbolen-ID's. Getallen variëren van 01 tot 09 wijzen op tumoren en 10 tot 19 op normale weefsels.1.2.Gesprek van ensemblegen-ID's aan gensymbolen. Importeer het annotatiebestand in R, afhankelijk van het opslagpad. Het annotatiebestand kan worden verkregen uit aanvullende bestanden.Voer de R-code uit vanuit het gtf v22-bestand. Die kan worden verkregen uit aanvullende bestanden / scripts. Pas de herbergfunctie toe en converteer de gen-ID's van het ensemble naar gensymbolen.1.3.Filter laag-uitgedrukte genen. Klik op uitvoeren om pakketrand te installerenR"Klik op uitvoeren om de R-pakketrand te laden"Voer de R-code uit om genen te behouden met aantallen per miljoen waarden groter dan één in ten minste twee voor beelden. Twee. Differentiële expressieanalyse via limma"Klik op Uitvoeren om R-pakket limma te installeren"Klik op Uitvoeren om R-pakket limma"edgeR te laden"Voer de volgende R-code uit om ontwerpmatrix te maken.Groepsinformatie extraheren. Stel 01" in als tumorweefsel. Stel 11"als normaal weefsel in.Ontwerpmatrix maken. Maak het object DGEList. Normaliseer de gegevens.Voer de volgende R-code uit om de op limma-trendmethode gebaseerde differentiële expressieanalyse uit te voeren. Bereken de CPM-waarde. Klik op Uitvoeren om een lineair model te passen om de gegevens te voorspellen of de relatie tussen variabelen af te leiden.Bereken de T-waarde, de F-waarde en de log-odds op basis van Bayesian. Pak de resultatentabel uit. De resultaten van differentiële expressieanalyse worden opgeslagen in res_limma", waaronder de log2-vouwwijzigingswaarde.Het gemiddelde log2 expressieniveau van het gen in het experiment. De gewijzigde T-statistiek, P-waarde, de valse detectiesnelheid corrigeerden de p-waarde en de log-odds van differentieel uitgedrukte genen. Identificeer de differentieel uitgedrukte genen.Dus de aangepaste P-waarde kleiner dan 0,05 en de absolute waarde van log false change groter dan of gelijk aan twee zijn drempels om de differentieel uitgedrukte genen te screenen. De resultaten res limma toont aan dat in vergelijking met de normale weefsels, 1, 443 genen up-gereguleerd zijn, en 1, 880 genen zijn down-gereguleerd in Cholangiocarcinoom weefsels. Voer de resultaattabel uit naar een bestand.Klik op Uitvoeren om R-pakket ggplot2 te installeren"Klik op Uitvoeren om R-pakket ggplot2 te laden"Voer R-code uit het vulkaanbestand uit om het vulkaanplot te maken en de bestandsvulkaan kan worden verkregen uit aanvullende bestanden. Genen kunnen worden toegewezen aan verschillende posities op basis van hun log2-vouwverandering en aangepaste P-waarden. Dus up-gereguleerde differentieel uitgedrukte genen zijn rood gekleurd.en de down-gereguleerde differentieel uitgedrukte genen zijn groen gekleurd. Klik op exporteren"om het vulkaanplot op te slaan. Drie. Differentiële expressieanalyse via edgeR"Klik op Uitvoeren om R-pakketrand te laden"Voer de volgende R-code uit om ontwerpmatrix te maken.Klik op Uitvoeren om het DGEList-object te maken en de gegevens te normaliseren. Klik op Uitvoeren om de dispersie van de genexpressiewaarde te schatten. Klik op Uitvoeren om het model aan te passen om gegevens te tellen.Voer een statistische test uit. De resultaattabel extraheren. Het resultaat wordt opgeslagen in res edgeR", waaronder de wijzigingswaarde van de logboekvouw, logCPM, F, p-waarde en de fout-detectiesnelheid gecorrigeerde p-waarde.Identificeer de differentieel uitgedrukte genen. Het resultaat res edgeR"toont aan dat in vergelijking met de normale weefsels, 3, 121 genen up-gereguleerd zijn, en 1, 578 genen zijn down-gereguleerd in Cholangiocarcinoom weefsels. Voer de resultaattabel uit naar een bestand.Maak het vulkaanperceel. Klik op exporteren om het vulkaanplot op te slaan. Vier. Differentiële expressieanalyse via DESeq2.Klik op Uitvoeren om R-pakket DESeq2 te installeren"Klik op Uitvoeren om R-pakket DESeq2 te laden"Voer de volgende R-code uit om de gropingfactor te bepalen. Maak het DESeq2-gegevenssetobject. Voer een analyse uit.Genereer de resultatentabel. Het resultaat wordt opgeslagen in res DESeq2, dat het gemiddelde van het genormaliseerde aantal lees, de wijzigingswaarde van de logboekplooi, de standaardpijl voor het wijzigen van de logboekvouw, de lasstatistiek, de oorspronkelijke P-waarde en de gecorrigeerde P-waarde omvat. Identificeer DEG's.Het resultaat res DESeq2 toont aan dat in vergelijking met de normale weefsels, tweeduizend negenhonderd achtendertig genen zijn up-gereguleerd, en duizend zeshonderd zestien genen zijn down-gereguleerd in Cholangiocarcinoom weefsels. Voer de resultaattabel uit naar een bestand. Maak het vulkaanperceel.Klik op exporteren om het vulkaanplot op te slaan. Vijf. Venn diagram. Klik op Uitvoeren om het venn-diagram van het R-pakket te installeren.Klik op Uitvoeren om het venn-diagram van het R-pakket te laden. Maak een venndiagram van up-gereguleerde differentieel uitgedrukte genen. Klik op exporteren om het bestelwagendiagram op te slaan, Maak een venndiagram van downgereguleerde differentieel uitgedrukte genen.Klik op exporteren om het venn-diagram op te slaan. Zes. Representatieve resultaten. Figuur één toont de vulkaanplots van alle genen verworven door limma, edgeR en DESeq2.Negatieve log p-waarde wordt geplot tegen de wijziging van de logboekvouw. Rode punten vertegenwoordigen de omhoog-gereguleerde differentieel uitgedrukte genen, en de groene punten vertegenwoordigen de naar beneden gereguleerde differentieel uitgedrukte genen. Limma identificeert de duizend achthonderdtachtig down-gereguleerde differentieel uitgedrukte genen, en de duizend vierhonderddrieenveertig omhoog-gereguleerde differentieel uitgedrukte genen in Cholangiocarcinoom weefsels.EdgeR identificeert de duizend vijfhonderd achtenzeventig down-gereguleerde differentieel uitgedrukte genen, en drieduizend eenentwintig omhoog-gereguleerde differentieel uitgedrukte genen. DESeq2 identificeert duizend zeshonderd zestien down-gereguleerde differentieel uitgedrukte genen, en tweeduizend negenhonderd achtendertig up-gereguleerde differentieel uitgedrukte genen. Figuur twee, venn diagrammen tonen overlap tussen de resultaten scheiding van limma edgeR en DESeq2.Vergelijk de resultaten van deze drie methoden, Duizend vierhonderd eenendertig omhoog-gereguleerde differentieel uitgedrukte genen, en duizend vijfhonderd en eenendertig down-gereguleerde differentieel uitgedrukte genen overlappen elkaar. Seven.Conclusion. In dit protocol hebben we hier een gedetailleerd protocol van verschillende soorten meetanalyses voor een hoge reeks telgegevens verstrekt met behulp van R-pakketten, limma, edgeR en DESeq2. Drie methoden hebben vergelijkbare en medewerkers in hun analyseproces.En dan overlappen hun van die drie medicijnen gedeeltelijk. Alle drie de geneesmiddelen hebben hun eigen voordelen. En de keuze hangt af van het tijdstip van uw gegevens.Als er mijn huidige gegevens zijn, moet limma prioriteit krijgen, maar generatiesequencinggegevens, in edgeR en DESeq2 hebben de voorkeur.

three-differential-expression-analysis-methods-for-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Dit protocol geeft een volledige en gedetailleerde procedure voor RNA-seq, een krachtige volgende generatie DNA sequencing technologie, toepassing profiel transcriptomen in menselijke long microvasculaire endotheliale cellen met of zonder behandeling trombine. Dit protocol is generaliseerbaar verschillende cellen of weefsels die door verschillende reagentia of ziekten.

RNA-seq Analyse van transcriptomen in trombine-behandelde en Control Human Pulmonary microvasculaire endotheelcellen

RNA-sequencing en bioinformatica analyses werden significant verschillend tot expressie en transcriptiefactoren in Lin-CD34 + en CD34-Lin subpopulaties van muis EMLcells identificeren. Deze transcriptiefactoren kunnen een belangrijke rol spelen bij het bepalen van de switch tussen zelfvernieuwende Lin-CD34 + en gedeeltelijk gedifferentieerd Lin-CD34-cellen.

Identificatie van Key factoren die de Self-vernieuwing en differentiatie in EML Hematopoietic voorloper cellen door RNA-sequencing Analyse

We beschrijven een op getarget RNA-sequencing gebaseerde methode die de voorbereiding van geïndiceerde cDNA-bibliotheken, hybridisatie en captuur met aangepaste sondes en data-analyse om geselecteerde transcripten te onderzoeken op genexpressie, mutaties en genfusies omvat. Getarget RNAseq maakt een kosteneffectieve, snelle evaluatie van geselecteerde transcripten mogelijk op een desktop sequencer.

Gerichte RNA Sequencing Assay Gene Expression en Genomic Wijzigingen karakteriseren

Dit protocol biedt een aanpak voor de hele transcriptome analyse van zebravis embryo's, larven, of cellen gesorteerd. Wij omvatten isolatie van RNA, pad analyse van RNASeq gegevens en qRT-PCR-gebaseerde validatie van gen expressie veranderingen.

Bereiding van de monsters en de analyse van de RNASeq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis

Dit protocol beschrijft het combinatorische gebruik van ChIP-seq, 4sU-seq en totaal RNA-seq ribosoom profilering voor cellijnen en primaire cellen. Hierdoor wijzigingen bijhouden in transcriptiefactor bindend, DOVO transcriptie, RNA-verwerking, omzet en vertaling na verloop van tijd, en de algemene gang van zaken in geactiveerd en/of snel veranderende cellen weer te geven.

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Hier gepresenteerd is een stapsgewijze procedure voor in vitro differentiatie van de menselijke primaire keratinocyten door contactremming gevolgd door karakterisering op moleculair niveau door RNA-seq analyse.

Karakterisering van in vitro differentiatie van de menselijke primaire keratinocyten door RNA-Seq Analyse

Deze methode beschrijft de stappen om de kwaliteit en kwantiteit van sequentiegegevens te verbeteren die kunnen worden verkregen uit formeel vaste paraffine-embedded (FFPE) RNA-monsters. We beschrijven de methodologie om de kwaliteit van FFPE-RNA-monsters nauwkeuriger te beoordelen, sequencingbibliotheken voor te bereiden en de gegevens van FFPE-RNA-monsters te analyseren.

Optimalisatie voor sequencing en analyse van gedegradeerde FFPE-RNA Samples

DiCoExpress is een script-gebaseerde tool geïmplementeerd in R om een RNA-Seq analyse uit te voeren van kwaliteitscontrole tot co-expressie. DiCoExpress verwerkt een compleet en onevenwichtig ontwerp tot 2 biologische factoren. Deze videozelfstudie leidt de gebruiker door de verschillende functies van DiCoExpress.

Multifactoriële RNA-Seq-experimenten analyseren met DiCoExpress

Alternatieve splicing (AS) en alternatieve polyadenylation (APA) vergroten de diversiteit van transcriptisovormen en hun producten. Hier beschrijven we bioinformatische protocollen om bulk RNA-seq en 3'-eindsequencingtests te analyseren om AS en APA te detecteren en te visualiseren, variërend tussen experimentele omstandigheden.

Identificatie van alternatieve splicing en polyadenylation in RNA-seq-gegevens

Het huidige werk beschrijft een protocol voor het uitvoeren van het Pathway2Targets-algoritme, een R-script dat therapeutische doelen voorspelt en prioriteert op basis van het profiel van intracellulaire signaalroutes die worden gegenereerd door casus- versus controlemonsters van een bulk-RNA-sequencing-experiment te vergelijken.

Gebruik van humane differentieel tot expressie gebrachte genlijsten om downstream pathway verrijkingsanalyse en prioritering van doelen uit te voeren

Dit protocol maakt een eerste kwaliteitscontrole mogelijk voor RNA-seq-experimenten voor wet-lab biologen met beperkte bio-informatica-ervaring.

Rup (RNA-seq Usability Assessment Pipeline) - Kwaliteitscontrole voor bulk RNA-seq-experimenten in eukaryoten

Leer differentiële expressieanalyse van RNA-sequencinggegevens met limma, EdgeR en DESeq2 in RStudio. Deze methoden vergelijken genexpressie in cholangiocarcinoom en identificeren gereguleerde genen voor bioinformatica-onderzoek.

Drie differentiële expressieanalysemethoden voor RNA-sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

Meer video's verkennen