RIBO-seq in Bacteria: een Sample Collection and Library Preparation Protocol voor NGS Sequencing

De ribosoomprofileringstechniek, ook wel RIBO-seq genoemd, is momenteel het meest effectieve hulpmiddel voor het bestuderen van het proces van eiwitsynthese in vivo. Het voordeel van deze methode is het vermogen om de vertaling te controleren door de positie en het aantal ribosomen nauwkeurig in kaart te brengen. RIBO-seq is gebaseerd op het feit dat het ribosoom, door binding aan het mRNA-molecuul, het begraven fragment van het transcript beschermt bij de vertering van ribonuclease.

De verkregen fragmenten, ribosomale voetafdrukken genoemd, kunnen worden gesequenced en in kaart gebracht op het transcript waaruit ze afkomstig zijn, wat resulteert in de bepaling van de exacte positie van de ribosomen. Gelijktijdig met de RIBO-seq wordt een totale mRNA-sequencing met hoge doorvoer uitgevoerd om een referentiepunt te bieden en de vergelijking van gegevens van zowel RIBO-seq als RNA-seq tijdens gegevensanalyse mogelijk te maken. Voordat cellen worden geoogst, kunt u optioneel chlooramfenicol toevoegen aan de bacteriecultuur, tot de uiteindelijke concentratie van 100 microgram per milliliter, om de vertaling te remmen.

Incubeer de cultuur met het antibioticum gedurende één minuut. Deze stap is belangrijk als het oogsten langer duurt dan normaal, omdat vertaalremming het mogelijk maakt om de verzameltijd van het monster te verlengen. Verzamel de monsters met een voorverwarmd filtratiesysteem.

U kunt schudden introduceren om groeiomstandigheden na te bootsen. Stop met filteren wanneer alle media door het membraan zijn gegaan, maar laat het filter niet volledig drogen. Verzamel bacteriële pellets door de cellen snel van de filterschijf te schrapen met behulp van een voorverwarmde, gedesinfecteerde scoopula.

Plaats onmiddellijk de hele scoopula met de geoogste cellen in een buis van 50 milliliter gevuld met vloeibare stikstof. De geoogste pellet moet volledig bedekt zijn met vloeibare stikstof. Laat de pellet goed invriezen en laat bevroren cellen los met behulp van een eerder afgekoelde scoopula.

Sluit het deksel en zorg ervoor dat het doorboord is. Dit is belangrijk, omdat vloeibare stikstof ervoor kan zorgen dat gesloten containers exploderen als gevolg van de drukverandering bij verdamping. Bereid GMPP, DNA-swab en verse Eppendorf-buizen voor lysase.

Bereid de lysisbuffer voor met de toevoeging van chlooramfenicol indien nodig. Wijs 500 microliter lysisbuffer per monster toe aan afzonderlijke Eppendorf-buizen en plaats ze op ijs. Ontsmet mortel en stamper met een laboratoriumdesinfectiemiddel en 70% ethanol.

Koel mortel en stamper door vloeibare stikstof in de mortel te gieten. Breng de bevroren bacteriële pellet over in een voorgekoelde mortel en maal deze tot een poeder. Voeg ongeveer één volume aluminiumoxide toe en blijf malen.

Houd mortel, stamper en de cellen koel door vloeibare stikstof te gieten wanneer dat nodig is, om de inhoud van de mortel niet te laten ontdooien. Voeg vlak voor gebruik GMPPNP en DNA-swab toe aan de lysisbuffer aliquot. Breng de oplossing over in de mortel en blijf malen.

Laat de lysase langzaam ontdooien tijdens het malen. Wanneer de lysase volledig ontdooit, breng het mengsel over in de voorgekoelde Eppendorf-buis en keer terug naar ijs. Centrifugeer lysase op 20.0000 G gedurende vijf minuten bij vier Graden Celsius.

Breng supernatanten over in verse, voorgekoelde Eppendorf-buizen en leg ze op ijs. Meet de RNA-concentratie in elk verdund monster met NanoDrop. Verdeel elk lysaat in twee porties, 0,5 tot 1 milligram RNA voor RIBO-seq en de rest voor RNA-seq.

Voeg aan één milligram van het RNA 3,8 microliter MNase toe in Tris pH 8 en vul het aan met lysisbuffer tot het totale volume van 500 microliters. Incubeer op 25 Graden Celsius, 300 ronden per minuut, gedurende 45 minuten. Wanneer de incubatie is voltooid, reinigt u de monsters met een in de handel verkrijgde RNA-opruimset.

Bereid 15% polyacrylamide TBE-gel met acht molaire ureum en plaats deze in een tank met TBE-buffer. Voorloop minimaal 10 minuten bij een constante spanning van 200 volt. Meng de monsters met de TBE-Ureum monsterbuffer.

Denature op 95 Graden Celsius gedurende een minuut en plaats ze onmiddellijk op ijs. Was het ureum uit door de TBE-buffer met een spuit in gelputten te injecteren. Laad de monsters, laat een putruimte tussen hen om elk monster te scheiden en kruisbesmetting te voorkomen.

Gebruik 29 nucleotiden-lang oligo, en een mix van 26 en 32 nucleotiden-lange oligo's als markers. Voer de elektroforese uit op een constante spanning van 180 volt. Bereid steriele buffer voor op nachtelijke incubatie.

Zodra de elektroforese is voltooid, beitst u de gel met SYBR Gold. Verwijder fragmenten van de gel tussen 26 en 32 nucleotiden met een steriele naald of een scheermesje en plaats de gelfragmenten in afzonderlijke Eppendorf-buizen. Vervang de naald of het scheermesje tussen de monsters.

Voeg 200 microliter nachtelijke incubatiebuffer toe aan elke Eppendorf en incubeer de monsters 's nachts op 10 Graden Celsius, 1000 ronden per minuut. Reinig de volgende dag de monsters met RNA-opruimkit en elute ze in 18 microliters nucleasevrij water. De verkregen ribosomale voetafdrukken zijn klaar voor de voorbereiding van de bibliotheek.

Voer ribosomale RNA-uitputting uit voor monsters voor RNA-seq met behulp van een in de handel verkrijgde kit. Reinig vervolgens de monsters met de RNA-opruimset. Voer de alkalische hydrolyse als volgt uit; bereid de alkalische hydrolysebuffer voor, voeg één volume van de buffer toe aan één volume van het monster en incubeer gedurende 25 minuten bij 95 Graden Celsius.

Voeg vijf microliters van 3 molair natriumacetaat pH 5,5 toe aan elk monster om de reactie te stoppen. Reinig de monsters met RNA-opruimkit en ontleed ze in 18 microliters nucleasevrij water. Het verkregen willekeurig gefragmenteerde RNA is klaar voor de voorbereiding van de bibliotheek.

Voeg 10 microliters 10x reactiebuffer en vijf microliters T4 polynucleotidekinase toe aan elk monster. Incubeer anderhalf uur bij 37 Graden Celsius. Voeg na deze tijd drie microliters van één millimolar ATP toe en incubeer gedurende een uur bij 37 Graden Celsius.

Reinig vervolgens de monsters met de RNA-opruimset. Voer de bibliotheekvoorbereiding uit met behulp van de in de handel verkrijgde kit, volgens het hier verstrekte protocol. Voer PAGE uit met 6%polyacrylamide gel.

Beits de gel met SYBR Gold. Accijnsgelfragmenten met de bibliotheken. Voor RNA-seq monsters, de bibliotheek is tussen 135 en 180 nucleotiden, en voor RIBO-seq, tussen 135 en 170 nucleotiden.

Gebruik steriele naalden of scheermesjes en plaats de gelfragmenten in aparte Eppendorf-buizen. Vergeet niet om de naald of het scheermesje tussen de monsters te vervangen. Voeg 100 microliter nucleasevrij water toe aan elk gelfragment.

En incubeer ze op 10 Graden Celsius, 450 kogels per minuut, 's nachts. Maak de volgende dag de monsters schoon met een DNA-opruimset. De verkregen bibliotheken zijn klaar voor kwaliteit- en kwantiteitscontrole met hoge gevoeligheid, DNA-on-chip elektroforese en vervolgens voor de volgende generatie sequencing.

De resulterende cDNA-bibliotheken bieden een passende hoeveelheid en kwaliteit die nodig is voor de volgende generatie sequencing, zoals geverifieerd door hoge gevoeligheid, DNA-on-chip elektroforese. De banden en pieken die de RIBO-seq-bibliotheken vertegenwoordigen, zijn smaller en beter gedefinieerd, in vergelijking met deze die de RNA-seq-bibliotheken vertegenwoordigen. Volgens de on-chip elektroforese hebben de bibliotheken de verwachte lens.

De extra pieken dichter bij 200 basisparen in RIBO-seq-bibliotheken kunnen wijzen op sluimeringen van ribosomen, niet volledig verteerde ribosomale voetafdrukken of artefacten, bijvoorbeeld rRNA, en kunnen worden verwijderd tijdens bioinformatische analyse wanneer de gegevens die zijn verkregen uit sequencing worden bijgesneden en rRNA tRNA wordt gefilterd. De gemiddelde hoeveelheid cDNA die wordt gegenereerd bij de voorbereiding van de bibliotheek is 32 nanogram, wat voldoende hoeveelheid materiaal oplevert die nodig is voor de volgende generatie sequencing. Na kwaliteitscontrole door on-chip elektroforese werden bibliotheken getrokken voor single en 50 base pair sequencing op een Illumina's NextSeq 500 platform.

Het trimmen van de adapters en sequenties van slechte kwaliteit resulteerde in 25 tot 47 miljoen aflezingen per monster voor RNA-seq-monsters en 25 tot 50 miljoen aflezingen per monster voor RIBO-seq-monsters. De verkregen gegevens werden gecontroleerd op kwaliteitscontrole met FastQC. Zowel RNA-seq als RIBO-seq monsters presenteerden een zeer goede kwaliteit.

Het in kaart brengen van de bibliotheken die volgens het beschreven protocol zijn opgesteld, leverde 2,4 tot 9,6 miljoen uniek in kaart gebrachte leesingen per monster op voor RNA-seq-monsters en 2,3 tot 10,4 miljoen uniek in kaart gebrachte leesgegevens voor RIBO-seq-monsters. RIBO-seq-gegevens vertonen een verdrievoudigde periodiciteit en een hoge, smalle piek, die overeenkomt met de initiërende ribosomen en kenmerkend is voor de ribosomale voetafdrukken, wat niet wordt waargenomen in de RNA-seq-gegevens. Bovendien onthult het plot met de profielen van de gemiddelde dekking van ribosomale voetafdrukken en mRNA-fragmenten op de coderingssequenties het hogere percentage leesingen dat is toegewezen aan de CDS's in de RIBO-seq-gegevensset, zoals verwacht.

De visualisatie van de in kaart gebrachte ribosomale voetafdrukken vertoonde zeer vergelijkbare patronen in vergelijking met de resultaten van hetzelfde experiment dat dienovereenkomstig werd uitgevoerd volgens de standaard RIBO-seq-procedure, die monosoomherstel door sucrose gradiënt ultracentrifugatie omvat. Ons protocol is gebruikt om vertaalregulatie in verschillende groeiomstandigheden te onderzoeken, maar kan worden toegepast om andere aspecten van vertaling te bestuderen, zoals detectie van vertaalinitiatiesites en nieuwe eiwitcoderingsgenen. Sequencing van de bibliotheken opgesteld volgens onze richtlijnen resulteert in voldoende gegevens voor een uitgebreide bio-informatische analyse.

Het protocol dat we hier presenteren is snel, eenvoudig en kosteneffectief en kan worden uitgevoerd met standaard laboratoriumapparatuur.