Kwantificering van cellulaire dichtheden en antigene eigenschappen met behulp van magnetische levitatie
May 17th, 2021
Dit artikel beschrijft een op magnetische levitatie gebaseerde methode die specifiek de aanwezigheid van antigenen kan detecteren, oplosbaar of membraangebonden, door veranderingen in de levitatiehoogte van vanvangkralen met vaste dichtheden te kwantificeren.
Deze techniek maakt scheiding mogelijk van verschillende celtypen en cellen die verschillende processen ondergaan die uitsluitend gebaseerd zijn op dichtheid met weinig tot geen manipulatie in een korte periode van tijd. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat het minimaal invasief is, kleine volumes vereist, snelle resultaten biedt, niet afhankelijk is van klassieke uitleingen en dat er geen gespecialiseerd personeel nodig is. Deze techniek kan worden toegepast voor het opsporen van meerdere ziekten, bijvoorbeeld bloedarmoede en sepsis.
Gebruik om te beginnen het prikapparaat met één klik om in de vinger van de rhesusfactor positieve bloeddonor te prikken en verzamel 10 microliter bloed in één milliliter DPBS. Voeg een microliter fluorescerende kleurstof toe in een milliliter suspensie van de rhesusfactorpositieve cellen om het plasmamembraan fluorescerend te bevlekken en incubaleer bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Pellet de cellen door gedurende 15 seconden op 5.600 maal G te draaien en was de pellet driemaal met één milliliter DPBS.
Resuspend de pellet in één milliliter HBSS met calcium en magnesium. Gebruik het prikapparaat met één klik om in de vinger van de rhesusfactor negatieve bloeddonor te prikken en twee microliter bloed te verzamelen. Om de experimentele buis met alleen kralen te bereiden, voegt u 174 microliter HBSS met calcium en magnesium, één microliter IgG-controleparels, één microliter zware kralen met een dichtheid van 1,2 gram per milliliter en 24 microliter 500 millimolar gadolinium toe.
Voeg ter voorbereiding van de experimentele controlebuis met IgG 172 microliter HBSS met calcium en magnesium, één microliter IgG-controleparels, één microliter zware kralen, één microliter rhesusfactornegatief bloed, één microliter gekleurde rhesusfactorpositieve bloedsuspensie en 24 microliter 500 millimolar gadolinium toe. Voeg ter voorbereiding van de experimentele monsterbuis 172 microliter HBSS met calcium en magnesium, één microliter anti-RhD-gecoate kralen, één microliter zware kralen, één microliter rhesusfactornegatief bloed, één microliter gekleurde rhesusfactorpositieve bloedsuspensie en 24 microliter 500 millimolar gadolinium toe. Stel het magnetische levitatieapparaat in.
En laad 50 microliter van het monster in een capillaire buis totdat de buis is gevuld. Sluit de uiteinden van de capillaire buis af met een capillaire kit om ervoor te zorgen dat er geen bubbels zijn. Plaats de capillaire buis in de capillaire houder tussen de bovenste en onderste magneten, pas het podium en de focus aan voor optimaal zicht.
Wacht ongeveer vijf tot 20 minuten totdat de cellen en kralen zich op hun magnetische evenwichtspositie hebben gevestigd. Met behulp van dit protocol werden de bloedcellen gescheiden afhankelijk van de levitatiehoogte met behulp van het magnetische levitatieapparaat. Kralen met lage en hoge dichtheid werden gebruikt om dichtheids levitatiehoogten en maatreferenties te bieden.
De polymorfinucleaire cellen zweefden boven de rode bloedcellen met een concentratie van 21 millimolaire gadoliniumionen. Oude bloedcellen zweefden bij een concentratie van 60 millimolaire gadoliniumionen. De rode bloedcellen, polymorfinucleaire cellen en lymfocyten werden gescheiden bij een concentratie van 40 millimolaire gadoliniumionen op basis van hun intrinsieke dichtheden.
Het rhesusfactorantigeen werd gedetecteerd op de rode bloedcellen met behulp van IgG en anti-RhD-antilichaam gecoate kralen. De kraalrodooscelcomplexen werden niet gegenereerd in het IgG-controlemonster, maar de fluorescerend gekleurde rode bloedcellen gevangen door de rhesusfactorpositieve kralen werden gedetecteerd. De binding van de anti-RhB aan de rhesusfactorpositieve cellen creëerde een kralencelcomplex in het centrum met intermitterende dichtheid van de ongebonden kralen en de negatieve rode bloedcellen.
Verder werd de complexe formatie bevestigd door de uitgezonden fluorescentie te observeren. De B-kraalcomplexen gevormd tussen de kralen met hoge en lage dichtheid bedekt met de antilichamen voor CR1 en CD47 wijzen op de aanwezigheid van van rode bloedcellen afgeleide extracellulaire blaasjes. Het afdekken van het capillair zonder bubbels te introduceren is de meest uitdagende stap en vereist oefening.
Deze methode zou inzicht kunnen geven voor de hematologie, met name gericht op rode bloedcelziekten.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een op magnetische levitatie gebaseerde techniek voor de specifieke detectie van antigenen in bloedmonsters, met focus op hun dichtheidseigenschappen. De methode toont efficiëntie in het scheiden van verschillende celtypen en het identificeren van de rhesusfactor in rode bloedcellen met minimale invasiviteit en snelle doorlooptijd.
Belangrijkste Onderdeel van het Onderzoek
Onderzoeksgebied
- Diagnostische technieken in de hematologie
- Scheiden van celtypen op basis van fysische eigenschappen
- Detectie van bloedantigenen voor ziekte-identificatie
Achtergrond
- Belang van celdichtheid in bloedanalyse
- Uitdagingen in traditionele verwerking van bloedmonsters
- Toepassingen in het detecteren van aandoeningen zoals anemie en sepsis
Gebruikte Methoden
- Magnetische levitatie voor antigenendetectie
- Bloedmonsters van rhesusfactor positieve en negatieve donoren
- Fluorescente kleurstofkleuring en bead-gebaseerde assays
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle scheiding van bloedcellen op basis van hun dichtheden met behulp van magnetische levitatie
- Detectie van rhesusfactor antigenen door bead complexen
- Duidelijke differentiatie tussen polymorfonucleaire cellen, lymfocyten en rode bloedcellen
Conclusies
- De methode verbetert de capaciteit om bloedmonsters te analyseren met verminderde manipulatie
- Biedt een nieuwe weg voor onderzoek in hematologische aandoeningen
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Magnetic levitation enables rapid, label-free separation of cells based on intrinsic density, supporting early discovery workflows where target validation and phenotypic screening require minimal manipulation. The method provides quantitative readouts of antigen presence through bead-bead complex formation, offering a scalable approach for assay development in hematology-focused discovery programs. Its compatibility with standard imaging reduces dependency on specialized instrumentation, enhancing accessibility for cross-functional R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by separating cell subtypes based on density-linked metabolic and activation states.
- Operational Value: Supports functional target validation with minimal sample processing, reducing variability from manipulation steps.
- Predictive Value: Facilitates biomarker-aligned stratification of cell populations for de-risking target engagement hypotheses.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative antigen measurements via bead-bead complex levitation height, enabling dose-response analysis.
- Reproducibility: Provides standardized separation based on physical properties, minimizing batch-to-batch variability in cell-based assays.
- Platform Scalability: Compatible with smartphone or tablet imaging, supporting decentralized screening and point-of-need applications.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to hematological disease models, including anemia and sickle cell disease, through density-based cell separation.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by preserving native cell states during separation.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables early detection of circulating tumor cells and extracellular vesicles, supporting go/no-go decisions in oncology pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling assay-ready systems for downstream screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating cell subpopulations with distinct density profiles linked to differentiation status.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-based readouts for compound effect evaluation without reliance on fluorescent or enzymatic reporters.
- Analytics: Provides levitation height as a measurable output for comparing conditions and assessing target modulation.
- Translational Research: Maintains phenotypic integrity of separated cells, supporting continuity into functional validation assays.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable separation platform applicable across multiple target classes and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in cell-based assays through label-free separation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput via standardized magnetic equilibrium positioning.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing reagent dependency and specialized training needs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through early detection of rare cell populations and antigen levels.
Implementation Considerations
- Requires expertise in magnetic levitation setup and capillary handling to avoid bubble formation.
- Depends on access to tunable magnetic fields and density-calibrated bead systems.
- Necessitates standardization of bead-antigen coupling protocols for reproducible quantitative outputs.
- Adaptation to non-hematological systems may require optimization of bead density and magnetic parameters.
- Practical limitations include sensitivity to capillary sealing quality and equilibration time variability.
