Lichtgeïnduceerde GFP-expressie in zebravisembryo's met behulp van het optogenetische TAEL/C120-systeem

Dit protocol is belangrijk omdat het een optogenetische of door licht geactiveerde methode is voor het induceren van genexpressie in een intact organisme. In ons geval een zebravisembryo. Het voordeel van deze techniek is dat het licht gebruikt, als een inducerend middel, dat een zeer nauwkeurige, ruimtelijke en temporele controle van inductie mogelijk maakt.

Dit protocol zou nuttig zijn voor elke situatie waarin induceerbare genexpressie nuttig zou zijn. Dit omvat zaken als afstammingstracering, gain-of-function-assays of reddingsexperimenten. Om te beginnen positioneer je het LED-paneel ten opzichte van de petrischaaltjes met embryo's voor het leveren van 1,5 milliwatt per vierkante centimeter lichtkracht aan meerdere embryo's tegelijk.

Om het risico op fotoschade aan de Tail Transcriptional Activator te verminderen, plaatst u het licht met tussenpozen van één uur aan-uit met behulp van een timerrelais, als het langer dan drie uur verlicht. Verwijder de deksels van petrischaaltjes om lichtverstrooiing door condensatie te minimaliseren. Plaats petrischaaltjes met controle-embryo's en een lichtdichte doos voor donkere controles.

Verwijder embryo's van verlichting, na de gewenste activeringsduur. Gebruik voor totale RNA-extractie een RNA-extractiekit. Breng de embryo's terug in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en verwijder het overtollige eiwater.

Na het toevoegen van lysisbuffer homogeniseert u de embryo's met de plastic stamper. Breng het lysaat over naar een meegeleverde kolom en volg de instructies van de fabrikant om RNA te zuiveren. Bewaar het gezuiverde RNA, bij min 20 tot min 80 graden Celsius, tot gebruik of synthetiseer cDNA onmiddellijk uit één microgram, totaal RNA met behulp van de cDNA-synthesekit, door de instructies van de fabrikant te volgen.

Voeg één microgram RNA toe aan een dunne wand 0,2 milliliter, PCR-buis, met vier microliters, van vijf keer cDNA-reactiemastermix, gevolgd door de toevoeging van één microliter, van 20 keer reverse transcriptase-enzymoplossing. Maak vervolgens een eindvolume van 20 microliter, met nucleasevrij water. Plaats de buis in een geprogrammeerde Thermo cycler voor cDNA synthese.

Bewaar het gesynthetiseerde cDNA bij min 20 graden Celsius tot gebruik of onmiddellijk gebruik voor kwantitatieve beoordeling. Stel de kwantitatieve PCR-reacties in die cybergroene enzymmastermix bevatten. Vijfvoudig verdunde cDNA- en GFP-primers met een concentratie van 325 nanomolair in drievoud en voeren de reactie uit in een geprogrammeerde real-time PCR-machine.

Na voltooiing van de reactie analyseert u de smeltcurve om de reactiespecifiekheid te bepalen. Bereken lichtgeactiveerde inductie als vouwverandering ten opzichte van de controle-embryo's met behulp van de dubbele Delta CT-methode. En gebruik statistische software om de significantie te bepalen.

Na het verwijderen van de embryo's van verlichting, immobiliseer embryo's voor beeldvorming in 3% methylcellulose met 0,01% Tricaïne in glazen depressieglaasjes. Verkrijg fluorescentie- en brightfieldbeelden op een fluorescerende stereomicroscoop die is aangesloten op een digitale camera met behulp van standaard GFP-filterinstellingen. Voeg brightfield- en fluorescentiebeelden na de acquisitie samen met beeldverwerkingssoftware.

Kwantificering van de GFP-expressie duidde op inductie van expressie zodra 30 minuten na de blootstelling aan blauw licht. De niveaus van GFP-expressie bleven vervolgens toenemen tot zes uur, na activering gestaag. GFP-inductie werd ook kwalitatief beoordeeld door de fluorescentie-intensiteit op dezelfde tijdstippen na activering te onderzoeken.

GFP-fluorescentie boven achtergrondniveaus werd voor het eerst waargenomen na drie uur na activering en werd merkbaar helderder na zes uur na activering. Controle-embryo's voor alle tijdspunten, die in het donker werden gehouden, vertoonden daarentegen geen merkbare GFP-fluorescentie. Het activerende licht moet zich in het blauwe bereik van het zichtbare lichtspectrum bevinden.

Zowel kamerlicht als zonlicht bevat wat blauw licht. Zorg er dus voor dat u uw negatieve bedieningselementen beschermt tegen omgevingslichtbronnen. Het TAEL C120-systeem is genetisch gecodeerd en modulair en kan de expressie van elk interessant gen stimuleren.

Dus, in combinatie met andere technieken, kan het worden gebruikt om een reeks biologische vragen te beantwoorden.