Kwantificering van interbacteriële concurrentie met behulp van single-cell fluorescentiebeeldvorming
2 september 2021
Dit manuscript beschrijft een methode voor het gebruik van eencellige fluorescentiemicroscopie om bacteriële concurrentie in cocultuur te visualiseren en te kwantificeren.
Deze methode is ontworpen om contactafhankelijke concurrentie te kwantificeren via het type VI-secretiesysteem tussen bacteriestammen op het niveau van één cel. Deze techniek maakt gebruik van het totale celoppervlak in plaats van celtellingen om bacteriële competities te kwantificeren, waardoor het gemakkelijk wordt voor onderzoekers zonder toegang tot eigen beeldanalysesoftware. Deze methode kan eenvoudig worden aangepast om de concurrentie tussen diverse kweekbare microben te kwantificeren.
Bovendien kan de experimentele opstelling worden geoptimaliseerd voor gebruik op rechtopstaande of omgekeerde microscopen. Bereid om te beginnen de agarose pad-oplossing voor door 2% laagsmelt agarose op te lossen in mariene PBS. Verwarm de oplossing kort gedurende ongeveer 30 seconden in de magnetron en vortex totdat de agarose volledig is opgelost.
Bewaar deze oplossing in een waterbad van 55 graden Celsius totdat deze klaar is voor gebruik. Wikkel vervolgens vijf keer een stuk laboratoriumtape rond een glazen dia. Herhaal het omwikkelen van tape op dezelfde dia, zodat de afstand tussen de twee tapestukken iets kleiner is dan de breedte van de coverslip.
Om een vlak agarose padoppervlak te garanderen, pipetteer warme agarose-oplossing tussen de twee stukken tape en plaats onmiddellijk een coverslip bovenop, zodat de coverslip contact maakt met de vloeistof en eventuele bubbels in de agarose-oplossing naar buiten duwt. Laat de agarose pad minstens een uur stollen bij kamertemperatuur. Snijd vervolgens deze agarose pad met een scheermesje in vier 5 vierkante millimeter pads om te gebruiken voor beeldvorming.
Om de stammen voor te bereiden op co-incubatie, streept u elke stam uit bevroren voorraden op de LBS-agarplaten aangevuld met de juiste antibiotica en incubeert u 's nachts bij 24 graden Celsius. Kies de volgende dag twee kolonies van elke stam en resuspend de kolonies in antibioticum aangevuld LBS-medium. Incubeer geresuspendeerde kolonies 's nachts bij 24 graden Celsius met schudden met 200 rotaties per minuut.
De volgende ochtend repliceert subcultuur elke biologische één in 1.000 keer vers LBS-medium zonder antibiotica en incubeert totdat cellen een optische dichtheid van ongeveer 1,5 bij 600 nanometer bereiken. Meet en registreer de optische dichtheid op 600 nanometer voor alle monsters. Normaliseer elk monster tot een optische dichtheid van één door de cultuur te verdunnen met LBS-medium.
Meng de twee concurrerende stammen in een gelijke verhouding door 30 microliter van elke genormaliseerde stam toe te voegen aan een gelabelde buis van 1,5 milliliter. Vortex de gemengde soortcultuur gedurende één tot twee seconden. Meng de concurrerende stammen voor elke biologische replicatie en behandeling om in totaal vier gemengde stambuizen te genereren.
Concentreer elke gemengde cultuur drievoudig door te centrifugeren om te zorgen voor voldoende dichte concurrerende cellen voor contactafhankelijke doding tijdens co-incubatie. Gooi het supernatant weg, resuspend elke pellet in 20 microliter LBS-medium en voer concentratieprocedures uit voor elk monster. Als u een omgekeerde microscoop afbeeldt, begint u met het spotten van twee microliter van een gemengde cultuur op de nummer 1,5 coverslipbodem van een petrischaaltje van 35 millimeter en plaatst u de agarose-pad over de co-incubatieplek.
Plaats een 12 millimeter ronde glazen afdekplaat over de agarose pad. Herhaal het spotten en plaatsen van coverslip voor de resterende drie gemengde culturen, wat resulteert in vier gerechten die in beeld worden gebracht. Voordat u verder gaat, laat u de dia's ongeveer vijf minuten op het bankje zitten om de cellen op de agarpad te laten bezinken om beweging tijdens het beeldvormingsproces te voorkomen.
Begin met het focussen op cellen die DIC gebruiken om fotobleekende effecten te minimaliseren. Gebruik op basis van de gemiddelde grootte van een enkele bacteriële cel een oliedoelstelling van 100X. Pas de belichtingstijd en acquisitie-instellingen voor elk kanaal aan met minimale achtergronddetectie.
Selecteer ten minste vijf weergavevelden en verkrijg afbeeldingen in elk geschikt kanaal. Open de beeldanalysesoftware en importeer de te analyseren afbeeldingsbestanden. Converteer de afbeelding naar grijswaarden, scheid de kanalen en begin met het drempelwaarden en maken van een binair masker van de voorbewerkte afbeelding.
Selecteer Analyseren en selecteer vervolgens in het vervolgkeuzemenu schaal instellen en voer de juiste waarden in voor de microscopie-instelling. Ga vervolgens naar metingen instellen en selecteer Gebied. Selecteer op het tabblad Analyseren de optie Deeltjes analyseren met behulp van de standaardinstellingen.
Als er vuil in het monster aanwezig is, kan de grootte of circulariteit worden aangepast om niet-celdeeltjes eruit te filteren. Selecteer Weergeven en vervolgens Contouren zodat de uitvoer van filteranalyse een genummerd overzicht van alle geanalyseerde deeltjes bevat. Exporteer de metingen naar spreadsheetsoftware voor verdere analyse en grafieken.
De representatieve fluorescentiebeelden van elke experimentele behandeling worden getoond. Het concentreren van gemengde cultuur vóór spotting resulteerde in afgeronde of verdwenen doelcellen gedurende twee uur, wat wijst op succesvolle remming. Wanneer de gemengde cultuur niet geconcentreerd is, blijven cellen verspreid op de dia.
Zonder voldoende cel-tot-celcontact wordt de doelstam niet geremd door de dodelijke stam. De doelcellen verdwenen niet en werden niet afgerond wanneer ze samen met een T6SS-mutant in drukke of verspreide omstandigheden werden geïncubeerd. Het doelwit was dus onbevangen in beide behandelingen.
De deeltjesanalyseresultaten werden in een grafiek weergegeven en geanalyseerd voor zowel doelstam als inhibitorstam. Meer dan 100% van het oorspronkelijke doelgebied op het laatste tijdstip betekent een nettotoename van het streefcijfer en minder dan 100% van het oorspronkelijke doelgebied duidt op een nettodaling van het streefcijfer. De nettogroei van de inhibitorstam werd waargenomen bij alle behandelingen.
Het percentage van het oorspronkelijke gebied voor de inhibitorstam was echter significant hoger wanneer een wild-type remmer werd geco-geïncubeerd met het doelwit in drukke omstandigheden in vergelijking met alle andere behandelingen. Om duidelijke beelden te krijgen, moet de agarose pad zo plat mogelijk zijn. Knip stukjes tape voordat je ze om de dia wikkelt om ervoor te zorgen dat ze dezelfde lengte hebben.
Overzicht
Deze studie presenteert een methode die gebruik maakt van single-cell fluorescentiemicroscopie om bacteriële concurrentie in cocultuur te onderzoeken, met focus op contact-afhankelijke concurrentie gemedieerd door het type VI secretiesysteem. Het protocol maakt kwantificering mogelijk op basis van totale celadheid, waardoor het toegankelijk is voor onderzoekers zonder gespecialiseerde beeldanalysesoftware.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Onderzoeksgebied
- Microbiële concurrentie
- Cellulaire interacties
- Fluorescentiemicroscopie technieken
Achtergrond
- Contact-afhankelijke concurrentie tussen bacteriën is cruciaal voor het begrijpen van microbiële ecologie.
- Het type VI secretiesysteem speelt een belangrijke rol in inter-bacteriële interacties.
- Bestaande methoden kunnen gespecialiseerde software vereisen, wat de toegankelijkheid voor veel onderzoekers beperkt.
Gebruikte methoden
- Single-cell fluorescentiemicroscopie
- Kwantificering van bacteriële concurrentie met behulp van totale celadheid
- Stapsgewijze voorbereiding van agarose pads en bacteriestammen voor beeldvorming
Belangrijkste resultaten
- De concentratie van gemengde culturen verbeterde effectief de remming van doelcellen.
- Aangetoond dat de netto groei van remmende stammen varieert onder verschillende omstandigheden.
- Benadrukt de belangrijkheid van cel-tot-cel contact in de effectiviteit van remming.
Conclusies
- De studie toont een eenvoudige en aanpasbare methode voor het kwantificeren van bacteriële concurrentie.
- Dit werk helpt bij het begrijpen van microbiële interacties en kan worden toegepast op verschillende cultiveerbare microben.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative single-cell fluorescence imaging of interbacterial competition enables precise interrogation of microbial interactions that shape microbiome structure and function. This approach provides reproducible, accessible measurement of competitive dynamics, supporting mechanistic de-risking and target validation in microbiome-focused discovery. The method's adaptability and quantitative outputs position it as a reusable capability for early-stage R&D and translational microbiome research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantification of contact-dependent bacterial antagonism at single-cell resolution.
- Supports functional validation of microbial effectors such as the type VI secretion system in competitive contexts.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing between contact-dependent and independent effects.
- Provides quantitative metrics for hypothesis-driven interrogation of microbial interactions.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible imaging workflows for evaluating competitive phenotypes across bacterial strains.
- Generates quantitative area-based outputs suitable for comparative analysis and downstream screening.
- Enables assay scalability and platform reuse across diverse culturable isolates and microbiome models.
- Supports robust evaluation of candidate strains or effectors in competitive environments.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant microbiome models by enabling quantification of interbacterial dynamics.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of microbial interventions.
- Supports risk-adjusted advancement of microbiome-targeted therapeutics based on quantitative competition data.
- Facilitates translational biomarker development by linking competitive outcomes to functional readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This fluorescence imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for microbiome-targeted R&D, supporting both hypothesis testing and quantitative screening.
- Discovery Biology: Quantifies competitive interactions to clarify microbial pathways and validate effector function.
- Screening: Provides reproducible, quantitative area measurements for robust comparison of strain phenotypes.
- Analytics: Enables statistical analysis of competitive outcomes using open-source image analysis tools.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical studies by supporting disease-relevant competition assays.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol supports broad application across microbiome research portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbial target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces biological risk in microbiome therapeutic pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to upright or inverted epifluorescence microscopes and open-source analysis software (FIJI/ImageJ).
- Demands cross-team standardization of slide preparation and imaging parameters for reproducibility.
- Adaptable to various culturable bacterial systems with protocol optimization for growth and imaging conditions.
- Dependent on high-quality agarose pad preparation and careful experimental setup for optimal imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Agarose Pad Preparation
1:47
Co-Incubation Strain Preparation
2:37
Bacterial Strains Coincubation
3:35
Slide Setup
4:17
Fluorescence Microscopy
4:46
Image Analysis
5:50
Results: Fluorescence Image Analysis to Assess Target Strain Inhibition in Coincubation Assay
7:08
Conclusion
