Classificatie van neurale stamcelactiveringstoestand in vitro met behulp van autofluorescentie
12 april 2024
Dit protocol beschrijft strategieën voor het identificeren en verrijken van de celtoestand in neurale stamcelculturen van primaire volwassen muizen door middel van autofluorescentiebeeldvorming met behulp van i) een confocale microscoop, ii) een fluorescerend geactiveerde celsorteerder om intensiteitsbeeldvorming uit te voeren, of iii) een multifotonenmicroscoop om fluorescentiebeeldvorming uit te voeren.
Dit protocol biedt een nieuwe benadering om de activeringstoestand van neurale stamcellen te classificeren met een cohort van technische voordelen. Met behulp van dit protocol kunnen we een analyse van de resolutie van neurale stamcellen zonder live cellabel van neurale stamcellen bereiken. Dit protocol kan worden gebruikt om licht te werpen op mechanismen die neurogenese bij volwassenen reguleren.
Autofluorescentie is veel zwakker dan veel fluoroforen waarmee onderzoekers gewend zijn te werken. Wees zelfverzekerd in het gebruik van hogere laservermogens om uw gegevens te verzamelen. Chris Morrow, een voormalige afgestudeerde student van mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren.
Begin met het configureren van de confocale microscoop voor autofluorescentiebeeldvorming. Klik op 405 Laser en typ het emissievenster onder het 405 lasermenu. Klik vervolgens op TD om een beeld van doorvallend licht te verzamelen en stel de HV-waarde in om het monster te visualiseren.
Stel het laservermogen in op 3.5% en stel de versterking in op 75. Stel de zoom in op twee. Voor de confocale scanparameters stelt u de pixelstilstand in op 0,5 en de resolutie op 2048 bij 2048 pixels.
Gebruik de 60X olie-onderdompelingsobjectieflens onder een helderveld om de cellen scherp te stellen. Klik op Eye Port om over te schakelen naar de confocale scanmodus. Zorg ervoor dat het lichtpad naar de scankop is gericht en controleer of er geen filterkubus is die het lichtpad blokkeert.
Klik op Scannen, focus op de afbeelding en klik op Vastleggen om afbeeldingen te verkrijgen van autofluorescentie in slapende neurale stamcellen en actieve neurale stamcellen. Zorg ervoor dat u beelden van één vlak verzamelt met het cytoplasma van cellen in focus voor een representatieve dwarsdoorsnede van elke cel. Begin met beeldvorming met lage laservermogens en verhoog geleidelijk het vermogen totdat het autofluorescentiesignaal detecteerbaar is zonder verzadiging te veroorzaken.
Analyseer slapende neurale stamcellen en actieve neurale stamcellen met een flowcytometer met behulp van een mondstuk van 130 micrometer. Pas optische omstandigheden toe volgens de mogelijkheden van het instrument en detecteer punctate autofluorescentie. Verzamel ten minste 10.000 singlet qNSC's en aNSC's in een gegevensbestand.
Gebruik deze gegevens om poorten te ontwerpen voor het verzamelen van een verrijkte populatie van qNSC's of aNSC's. Sorteer vervolgens de singletcellen in PLO-laminine-gecoate putjes gevuld met aNSC-medium. Laat neurale stamcellen na FACS drie uur incuberen.
Om de cellen te fixeren, voegt u 4%paraformaldehyde toe, zorg ervoor dat het voldoende is om de bodem van de schaal te bedekken en te incuberen. Permeabiliseer de cellen na 15 minuten met 0,25%Triton in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Behandel de cellen vervolgens gedurende 30 minuten met een EdU-kleuringsoplossing bij kamertemperatuur.
Was de monsters vervolgens drie keer gedurende 10 minuten met PBS. Begin met het gebruik van de oculair om een geschikt gezichtsveld te vinden en pas het lichtpad aan op het monster op de microscoop om beeldvorming in het donker met het multifoton mogelijk te maken. Instellen voor het verzamelen van kanaal één afbeelding.
Navigeer naar het tabblad vermogensversterking en pas de versterking op de PMT aan naar 800. Klik op het tabblad 2P-laser en selecteer 750 nanometer voor de lasergolflengte en zorg ervoor dat de juiste filterkubus wordt gebruikt. Om kanaal één afbeelding te verzamelen, klikt u op het tabblad Power Gain en stelt u de Pockels in op 30.
Ga vervolgens naar het scangedeelte van het scherm en klik op Live Scan om de voorbeeldmodus te starten. Verhoog de Pockels stapsgewijs om een geschikt gezichtsveld te bereiken bij een laag laservermogen. Zodra een geschikt gezichtsveld is geïdentificeerd, stelt u het laservermogen in op 3.6 milliwatt.
Ga vervolgens verder naar het scangedeelte en klik op enkele scan om een kanaal één-afbeelding van meer dan 60 seconden vast te leggen. Om een kanaal twee-afbeelding te verzamelen, klikt u op het tabblad 2P-laser en selecteert u 890 nanometer voor de laser. Vervang de filterkubus door de emissiekubus van kanaal twee.
Start de voorbeeldmodus. Verhoog de Pockels totdat de vermogensmeter ongeveer zeven milliwatt aangeeft en de CFD-tellingen tussen 10.000 en 100.000 liggen. Klik op een enkele scan en leg een beeld van kanaal twee vast met een duur van 60 seconden.
Confocale autofluorescentiebeeldvorming werd gebruikt om onderscheid te maken tussen slapende neurale stamcellen en geactiveerde neurale stamcellen. Het bleek dat qNSC's een hoger aantal PAF vertonen dan aNSC's, wat het gebruik van autofluorescentie als marker voor identificatie van de celtoestand aantoont. Met behulp van FACS werden NSC-celtoestanden verrijkt op basis van autofluorescentie.
Cellen gesorteerd uit de hoge autofluorescentiepoort vertoonden een lagere proliferatiesnelheid in vergelijking met het gemengde monster, terwijl die uit de lage autofluorescentiepoort meer proliferatief waren, wat de verrijking van NSC-activeringstoestanden bevestigt. Verder werd FLIM gebruikt om NSC-autofluorescentie te beoordelen en de activeringstoestand van NSC's te onderscheiden. Met name qNSC's vertoonden een hogere gemiddelde levensduur van fluorescentie in kanaal één, maar een lager aandeel van de fluorescentiecomponent alfa één in vergelijking met aNSC's.
Een logistisch regressiemodel met gegevens van beide kanalen leverde een bijna perfect voorspellend vermogen op voor NSC-activeringstoestanden, zoals aangegeven door een karakteristiekeme curve van de ontvangeroperator, wat het potentieel van FLIM bij het classificeren van NSC-toestanden onderstreept. Na deze procedure zou het goed zijn om resultaten te valideren met behulp van andere benaderingen om de activeringstoestand van neurale stamcellen te meten.
Overzicht
Dit protocol presenteert technieken voor het identificeren en verrijken van celtoestanden in primaire volwassen muis neurale stamcelculturen met behulp van autofluorescentiebeeldvorming. Het onderzoek maakt gebruik van confocale microscopie, fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en multifotonmicroscopie om neurale stamcelactivatietoestanden te analyseren, waardoor het begrip van volwassen neurogenese wordt verbeterd.
Belangrijkste onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Beeldvormingstechnologie
Achtergrond
- Neurale stamcellen (NSC's) spelen een cruciale rol in neurogenese en hersenherstel.
- Inzicht in NSC-activatietoestanden kan inzicht geven in hun rol in hersenfunctie.
- Huidige methoden misten nauwkeurige technieken om NSC-toestanden met single-celresolutie te beoordelen.
- Autofluorescentiebeeldvorming biedt een nieuwe benadering om levende cellen te analyseren zonder labeling.
Doel van het onderzoek
- Om een protocol te ontwikkelen voor levende cel, label-vrije analyse van neurale stamcelactivatietoestanden.
- Om rustige en geactiveerde neurale stamcellen te verrijken met behulp van autofluorescentie als marker.
- Om de mechanismen die volwassen neurogenese reguleren te onderzoeken door middel van verbeterde beeldvormingstechnieken.
Gebruikte methoden
- Beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een confocale microscoop en een multifotonmicroscoop.
- Primaire volwassen muis neurale stamcelculturen werden gebruikt als biologisch model.
- Er werden geen multiomics- of metabole analyses uitgevoerd in dit onderzoek.
- Het protocol omvatte stappen voor confocale setup, FACS voor celsortering en analyse van autofluorescentie.
- Kritieke stappen omvatten het optimaliseren van laservermogeninstellingen en het sorteren van celpopulaties op basis van autofluorescentie-intensiteit.
Belangrijkste resultaten
- Autofluorescentiebeeldvorming slaagde erin om rustige en geactiveerde NSC's te differentiëren op basis van signaalintensiteit.
- FACS maakte de verrijking van NSC's mogelijk, waardoor verschillen in proliferatiesnelheden tussen gesorteerd cellijnen werden aangetoond.
- Fluorescentielevensduurbeeldvorming (FLIM) onthulde significante verschillen in fluorescentielevensduur en componenten tussen qNSC's en aNSC's.
- Een logistiek regressiemodel gaf een sterk voorspellend vermogen voor het identificeren van NSC-activatietoestanden aan.
Conclusies
- Dit onderzoek maakt geavanceerde identificatie en analyse van neurale stamcelactivatietoestanden mogelijk, wat cruciaal is voor het begrijpen van neurogenese.
- Het gebruik van autofluorescentie en FACS belooft veel voor toekomstig onderzoek in neurale plasticiteit en stamcelbiologie.
- De verkregen inzichten kunnen therapeutische strategieën bij neurodegeneratieve aandoeningen informeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol provides a label-free, single-cell resolution method to classify neural stem cell activation states using autofluorescence, enabling mechanistic de-risking in target validation for neurogenesis-related pathways. By distinguishing quiescent and activated states without exogenous labels, it supports predictive confidence in early discovery and reduces biological ambiguity in stem cell-based therapeutic strategies. The approach enhances translational continuity from discovery through preclinical research by offering a reusable, scalable tool for assessing cell state dynamics in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by classifying NSC activation states based on endogenous autofluorescence markers.
- Operational Value: Supports biological de-risking through label-free, live-cell analysis that preserves native cell function during state discrimination.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by quantifying differences in proliferation and fluorescence lifetime between qNSCs and aNSCs using FACS and FLIM.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enriching qNSC or aNSC populations via FACS gating on autofluorescence intensity.
- Reproducibility: Standardizes activation state assessment through quantitative autofluorescence intensity and fluorescence lifetime measurements.
- Scalability: Enables platform reuse across studies by establishing a label-free method compatible with confocal, FACS, and multiphoton imaging.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with adult neurogenesis mechanisms, offering a translational biomarker-compatible system for studying NSC quiescence exit in preclinical models.
- Predictive De-risking: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking autofluorescence signatures to functional outcomes like proliferation rate and cell cycle re-entry.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing a consistent, label-free readout across imaging and sorting modalities.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, supporting assay development and analytics with quantitative, label-free outputs that inform go/no-go decisions in stem cell-targeted programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time classification of NSC activation states without perturbing native signaling.
- Screening: Delivers assay readiness through FACS-based enrichment of pure qNSC or aNSC populations for compound screening applications.
- Analytics: Provides quantitative readouts including autofluorescence intensity, fluorescence lifetime, and component analysis to compare activation states across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing longitudinal tracking of quiescent exit dynamics using FLIM in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across projects due to its label-free nature and compatibility with standard microscopy and flow cytometry infrastructure.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in NSC state transitions.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through instrument-agnostic autofluorescence metrics applicable across labs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of ineffective modulators of NSC activation, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that reliably modulate qNSC-to-aNSC transition with measurable fluorescence signatures.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, flow cytometry, and multiphoton FLIM for accurate signal detection and interpretation.
- Dependent on laser tuning and detector sensitivity due to the inherently low signal strength of endogenous autofluorescence.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters (laser power, gain, wavelength) to ensure reproducible activation state classification.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different NSC sources or culture conditions affecting autofluorescence background.
- Limited by the need for careful optimization to avoid photodamage while achieving sufficient signal-to-noise ratio for state discrimination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:39
Imaging Autofluorescence in Live qNSCs and aNSCs Using Confocal Microscope
2:13
Autofluorescence Based FACS Enrichment for NSC Activation State in Cultured NSCs
3:36
Using Multiphoton Microscope to Perform Fluorescence Lifetime Imaging on NSCs In Vitro
5:20
Results: Deciphering Neural Stem Cell Activation States Through Advanced Fluorescence Imaging Techniques
6:45
Conclusion
