Classificatie van neurale stamcelactiveringstoestand in vitro met behulp van autofluorescentie

Dit protocol biedt een nieuwe benadering om de activeringstoestand van neurale stamcellen te classificeren met een cohort van technische voordelen. Met behulp van dit protocol kunnen we een analyse van de resolutie van neurale stamcellen zonder live cellabel van neurale stamcellen bereiken. Dit protocol kan worden gebruikt om licht te werpen op mechanismen die neurogenese bij volwassenen reguleren.

Autofluorescentie is veel zwakker dan veel fluoroforen waarmee onderzoekers gewend zijn te werken. Wees zelfverzekerd in het gebruik van hogere laservermogens om uw gegevens te verzamelen. Chris Morrow, een voormalige afgestudeerde student van mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren.

Begin met het configureren van de confocale microscoop voor autofluorescentiebeeldvorming. Klik op 405 Laser en typ het emissievenster onder het 405 lasermenu. Klik vervolgens op TD om een beeld van doorvallend licht te verzamelen en stel de HV-waarde in om het monster te visualiseren.

Stel het laservermogen in op 3.5% en stel de versterking in op 75. Stel de zoom in op twee. Voor de confocale scanparameters stelt u de pixelstilstand in op 0,5 en de resolutie op 2048 bij 2048 pixels.

Gebruik de 60X olie-onderdompelingsobjectieflens onder een helderveld om de cellen scherp te stellen. Klik op Eye Port om over te schakelen naar de confocale scanmodus. Zorg ervoor dat het lichtpad naar de scankop is gericht en controleer of er geen filterkubus is die het lichtpad blokkeert.

Klik op Scannen, focus op de afbeelding en klik op Vastleggen om afbeeldingen te verkrijgen van autofluorescentie in slapende neurale stamcellen en actieve neurale stamcellen. Zorg ervoor dat u beelden van één vlak verzamelt met het cytoplasma van cellen in focus voor een representatieve dwarsdoorsnede van elke cel. Begin met beeldvorming met lage laservermogens en verhoog geleidelijk het vermogen totdat het autofluorescentiesignaal detecteerbaar is zonder verzadiging te veroorzaken.

Analyseer slapende neurale stamcellen en actieve neurale stamcellen met een flowcytometer met behulp van een mondstuk van 130 micrometer. Pas optische omstandigheden toe volgens de mogelijkheden van het instrument en detecteer punctate autofluorescentie. Verzamel ten minste 10.000 singlet qNSC's en aNSC's in een gegevensbestand.

Gebruik deze gegevens om poorten te ontwerpen voor het verzamelen van een verrijkte populatie van qNSC's of aNSC's. Sorteer vervolgens de singletcellen in PLO-laminine-gecoate putjes gevuld met aNSC-medium. Laat neurale stamcellen na FACS drie uur incuberen.

Om de cellen te fixeren, voegt u 4%paraformaldehyde toe, zorg ervoor dat het voldoende is om de bodem van de schaal te bedekken en te incuberen. Permeabiliseer de cellen na 15 minuten met 0,25%Triton in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Behandel de cellen vervolgens gedurende 30 minuten met een EdU-kleuringsoplossing bij kamertemperatuur.

Was de monsters vervolgens drie keer gedurende 10 minuten met PBS. Begin met het gebruik van de oculair om een geschikt gezichtsveld te vinden en pas het lichtpad aan op het monster op de microscoop om beeldvorming in het donker met het multifoton mogelijk te maken. Instellen voor het verzamelen van kanaal één afbeelding.

Navigeer naar het tabblad vermogensversterking en pas de versterking op de PMT aan naar 800. Klik op het tabblad 2P-laser en selecteer 750 nanometer voor de lasergolflengte en zorg ervoor dat de juiste filterkubus wordt gebruikt. Om kanaal één afbeelding te verzamelen, klikt u op het tabblad Power Gain en stelt u de Pockels in op 30.

Ga vervolgens naar het scangedeelte van het scherm en klik op Live Scan om de voorbeeldmodus te starten. Verhoog de Pockels stapsgewijs om een geschikt gezichtsveld te bereiken bij een laag laservermogen. Zodra een geschikt gezichtsveld is geïdentificeerd, stelt u het laservermogen in op 3.6 milliwatt.

Ga vervolgens verder naar het scangedeelte en klik op enkele scan om een kanaal één-afbeelding van meer dan 60 seconden vast te leggen. Om een kanaal twee-afbeelding te verzamelen, klikt u op het tabblad 2P-laser en selecteert u 890 nanometer voor de laser. Vervang de filterkubus door de emissiekubus van kanaal twee.

Start de voorbeeldmodus. Verhoog de Pockels totdat de vermogensmeter ongeveer zeven milliwatt aangeeft en de CFD-tellingen tussen 10.000 en 100.000 liggen. Klik op een enkele scan en leg een beeld van kanaal twee vast met een duur van 60 seconden.

Confocale autofluorescentiebeeldvorming werd gebruikt om onderscheid te maken tussen slapende neurale stamcellen en geactiveerde neurale stamcellen. Het bleek dat qNSC's een hoger aantal PAF vertonen dan aNSC's, wat het gebruik van autofluorescentie als marker voor identificatie van de celtoestand aantoont. Met behulp van FACS werden NSC-celtoestanden verrijkt op basis van autofluorescentie.

Cellen gesorteerd uit de hoge autofluorescentiepoort vertoonden een lagere proliferatiesnelheid in vergelijking met het gemengde monster, terwijl die uit de lage autofluorescentiepoort meer proliferatief waren, wat de verrijking van NSC-activeringstoestanden bevestigt. Verder werd FLIM gebruikt om NSC-autofluorescentie te beoordelen en de activeringstoestand van NSC's te onderscheiden. Met name qNSC's vertoonden een hogere gemiddelde levensduur van fluorescentie in kanaal één, maar een lager aandeel van de fluorescentiecomponent alfa één in vergelijking met aNSC's.

Een logistisch regressiemodel met gegevens van beide kanalen leverde een bijna perfect voorspellend vermogen op voor NSC-activeringstoestanden, zoals aangegeven door een karakteristiekeme curve van de ontvangeroperator, wat het potentieel van FLIM bij het classificeren van NSC-toestanden onderstreept. Na deze procedure zou het goed zijn om resultaten te valideren met behulp van andere benaderingen om de activeringstoestand van neurale stamcellen te meten.