Visualisatie van inflammatoire caspasen geïnduceerde nabijheid in menselijke monocyt-afgeleide macrofagen

Dit protocol is belangrijk omdat het kan worden gebruikt om de inflammatoire caspase-route op moleculair niveau in levende cellen in een bepaalde ziektetoestand te visualiseren en te ondervragen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om de componenten, vereisten en lokalisatie van de inflammatoire caspase-activeringscomplexen in primaire immuuncellen te identificeren. Met kleine optimalisaties kan deze methode worden aangepast aan andere primaire cellen en een reeks eiwitten die worden geactiveerd door oligomerisatie, en de toepasbaarheid ervan is niet beperkt tot microscopische methodologieën.

Adem eerst de media uit volledig gedifferentieerde macrofagen op 10 centimeter vaat en was de celmonolaag met warm serumvrij RPMI-1640-medium, waarbij alle media volledig worden verwijderd. Oogst de cellen door twee milliliter 0,25% warme trypsine-EDTA-oplossing per schaal van 10 centimeter toe te voegen. Pipetteer de trypsine-EDTA voorzichtig op en neer over de hele schaal met een P-1000 micropipette en breng de suspensie vervolgens over in een conische buis van 15 milliliter met vijf milliliter warm volledig kweekmedium.

Controleer op celloslating onder een heldere veldmicroscoop en maak indien nodig opnieuw los. Zuig het medium op en resuspend de cellen in 10 milliliter 1X steriel PBS voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Neem vervolgens een aliquot van 20 microliter om het celgetal te bepalen met behulp van een hemocytometer.

Neem één tot twee keer 10 tot de vijfde cel per transfectie en plaats ze in een buis van 15 milliliter. Breng tot een eindvolume van 15 milliliter met voorverwarmde 1X steriele PBS. Zuig de PBS aan en centrifugeer nog één keer gedurende één minuut bij 250 x g.

Verwijder eventuele resterende PBS uit de celkorrel met behulp van een P-200 micropipette. Neem een steriele microbuis per transfectie van 1,5 milliliter en voeg de juiste reporterplasmide en caspase BiFC-plasmiden toe aan de kap. Plaats het pipetstation, apparaat, tips, elektroporatiebuizen en pipet in een steriele laminaire stroomkap.

Sluit het nucleofectionapparaat aan en schakel het in. Voer de transsectieparameters in het weergegeven opstartscherm in. Druk op Voltage, voer 1000 in en druk op Gereed om het in te stellen op 1000 volt.

Druk op Breedte, voer 40 in en druk op Gereed om de puls in te stellen op 40 milliseconden. Druk ten slotte op Pulsen, voer 2 in en druk op Gereed om het aantal elektrische pulsen in te stellen op 2. Neem een van de elektroporatiebuizen en vul deze met drie milliliter elektrolytische buffer E bij kamertemperatuur.

Plaats de elektroporatiebuis in de pipethouder op het pipetstation en zorg ervoor dat de elektrode aan de zijkant van de buis naar binnen is gericht en dat er een klikgeluid wordt gehoord wanneer de buis wordt ingebracht. Neem de celkorrel en voeg 10 microliter voorverwarmde resuspensie R-buffer toe voor elke één tot twee keer 10 tot de vijfde cellen en meng voorzichtig met een P-20 micropipette. Voeg 10 microliter van de celsuspensie toe aan elke transfectiebuis en meng voorzichtig met een P-20 micropipette.

Steek een punt in de pipet door de drukknop tot de tweede stop in te drukken, zodat de klem de montagesteel van de zuiger in de punt volledig oppakt. Druk vervolgens op de drukknop op de pipet tot de eerste stop en duik in de eerste buis met cel- of plasmide-DNA-mengsel om het monster op te zuigen. Plaats de pipet met het monster zeer voorzichtig in de pipethouder, zorg ervoor dat de pipet klikt en op de juiste manier wordt geplaatst.

Druk op start op het aanraakscherm en wacht tot de elektrische pulsen worden geleverd. Verwijder de pipet langzaam uit het station en voeg onmiddellijk de getransceerde celsuspensie toe aan de overeenkomstige put met het voorverwarmde antibioticavrije medium door langzaam op de drukknop te drukken tot de eerste stop. Laat de plaat voorzichtig schommelen met getransecteerde cellen en incubeer gedurende één tot drie uur in een bevochtigde weefselkweekincubator en voeg vervolgens 200 microliter voorverwarmd kweekmedium toe aan elke put.

Plaats de schaal in de couveuse en wacht minstens 24 uur op genexpressie. Inspecteer de volgende dag de levensvatbaarheid van de cel en de transfectie-efficiëntie met behulp van een epifluorescentiemicroscoop. Verwijder de media voorzichtig uit de cellen met een P-1000 micropipette en voeg 500 microliter van de stimulusoplossing toe aan de zijkant van de put.

Om onbehandelde controleputten uit te voeren, voegt u een beeldvormend medium toe zonder de stimulus. Om de cellen te visualiseren met behulp van een epifluorescentie of confocale microscoop, schakelt u de microscoop en de fluorescerende lichtbron in volgens de instructies. Selecteer de 10 of 20 keer objectief en plaats de kweekschaal op het microscooppodium.

Zoek cellen onder het 568 nanometer filter met het oogstuk. En focus op de cellen die de reporter-rode bloedcellen tot expressie brengen. Tel alle rode bloedcellen in het gezichtsveld.

Terwijl u zich in hetzelfde gezichtsveld bevindt, schakelt u over naar de filters 488 of 512 en telt u het aantal rode bloedcellen dat ook groen is. Tel ten minste 100 rode bloedcellen van minimaal drie velden. Bereken het percentage Venuspositieve transected cellen per gezichtsveld en gemiddelde de resulterende percentages voor elke behandeling goed om de standaarddeviatie te krijgen.

Om de cellen in beeld te brengen met behulp van een epifluorescentie of confocale microscoop, visualiseer je het live beeld van de cellen op het computerscherm zoals verkregen door de camera. Verfijn de focus en positie van de cellen met behulp van de joystickbediening en het scherpstelwiel. Stel het percentage laservermogen en belichtingstijd in voor de 512 nanometer of 488 nanometer en 568 nanometer lasers, zodat het signaal in het beeld er goed uitziet zonder verzadiging.

Schakel de live-opname in en bekijk het resulterende beeld, zodat er voor elke verdieping een duidelijke piek te zien is in de histogrammen van het scherm voor beide kanalen. Terwijl u het live beeld van de cellen visualiseert, maakt u meerdere representatieve afbeeldingen van een veld dat een of meer cellen bevat die de mCherry- of dsRedmito-reporter voor elke put van de plaat tot expressie brengen. Geselecteerde CD-14 positieve monocyten geïncubeerd met GM-CSF gedurende zeven dagen vertoonden veranderingen in de celmorfologie in de loop van de differentiatieperiode, gaande van bolvormige suspensiecellen tot spichtig en volledig gehecht, en ten slotte tot meer verspreide cellen wanneer volledig gedifferentieerd.

Volledig gedifferentieerde cellen werden getransecteerd met de caspase BiFC-paren VC en VN samen met de reporter plasmide dsRedmito, die werd gebruikt om de getransecteerde cellen te labelen. Onbehandelde cellen vertoonden geen Venus-fluorescentie. En in met nigericine behandelde cellen verscheen caspase-1 BiFC als een enkel punctum met de typische vorm van ASC-stippen.

Kwantificering van Venus-positieve MDM toonde aan dat het hoogste percentage caspase-1 BiFC wordt gezien in de LPS plus nigericine behandelingsgroep. Op plasmidetitratie van caspase-1, 4 en 5 pro-BiFC-paren was het hoogste percentage Venus-positieve cellen het gevolg van respectievelijk 400, 500 en 1.000 nanogram getranscteerd plasmide. Confocale beelden verkregen met een 20 keer objectief van een veld van cellen 24 uur na transsectie toonden aan dat de onbehandelde transected cellen levensvatbaar zijn omdat mitochondriën intact zijn.

Na behandeling met heem verschijnt het caspase-1-complex als een enkel groen punctum vergelijkbaar met het punctuem dat wordt geïnduceerd door nigericine. Vergeet niet om zware omstandigheden en overmatige manipulatie van de cellen te vermijden tijdens differentiatie, transfectie en behandeling, omdat dit kan resulteren in een spontane activering en hoge achtergrondniveaus van caspase-activering.