Geoptimaliseerde botbemonsteringsprotocollen voor het ophalen van oud DNA uit archeologische overblijfselen

Deze protocollen dienen als richtlijnen voor best practices voor het genereren van botpoeder voor gebruik in de downstream DNA-extractie over een reeks skeletelementen. Er zijn een paar gepubliceerde oude DNA-bemonsteringsprotocollen voor andere locaties dan het dentine en de petrouspiramide. Vandaag laten we de gedetailleerde bemonsteringsmethoden voor drie alternatieven zien.

Deze methoden vertonen ook een groot potentieel voor gebruik met gedegradeerde forensische resten, maar ook als basis voor het ontwikkelen van vergelijkbare technieken met niet-menselijke exemplaren. Voer alle monsters uit in een speciale cleanroom, onder een PCR-kap met UV-licht of bioveiligheidskast. Schakel de luchtstroom uit en verdeel steriele aluminiumfolie over het bankblad om verdwaald botpoeder of fragmenten op te vangen.

Leg een vel weegpapier in een steriele weegschaal. Houd de ontsmette kies bij het glazuur met de wortel naar beneden gericht over een weegschaal, met behulp van een handklem. Rust een tandartsboor uit met een cirkelvormig snijwiel met diamantrand.

Met de boor ingesteld op een gemiddelde snelheidsinstelling, raakt u de rand van de boor lichtjes aan de wortel onder een hoek van ongeveer 20 graden. Schraap het monster naar beneden in de lade om het gele, buitenste materiaal van de wortel te verzamelen. Stop met verzamelen zodra het lichtere materiaal van het dentine zichtbaar wordt.

Breng het poeder over in een LoBind Safe-Lock-buis van twee milliliter en noteer deze verzamelde massa poeder met behulp van een gesloten balans met een nauwkeurigheid van ten minste 0,01 milligram. Breng het poeder van het weegpapier over in een LoBind Safe-Lock buis van twee milliliter voor extractie. Bewaar deze buis bij 20 graden Celsius.

Zorg ervoor dat alle botfragmenten en zoveel mogelijk poeder worden teruggewonnen. Vervang de folie tussen elk monster en gooi de gebruikte folie weg in een autoclaafbare biohazard-zak. Ontsmet het werkgebied en verdeel steriele aluminiumfolie elke keer over het bankblad voordat u naar het volgende bot gaat.

Plaats een klein vel weegpapier in een standaard weeglade. Verwijder en gooi de buitenste laag van het corticale bot van de superieure wervelboog met behulp van een tandboor. Bevestig vervolgens de wervels in een handklem, met het processus spinosus naar buiten en het superieure aspect naar beneden.

Terwijl u de wervel vasthoudt, boort u omhoog in het midden van de V-vormige inkeping, gevormd door de fusie van het spineuze proces met de lamellen met lage snelheid en hoog koppel. Stop met boren wanneer er een merkbare daling van de weerstand is. Verander de boorpositie enigszins en herhaal dit totdat 50 tot 100 milligram botpoeder is verzameld.

Breng het botpoeder van het weegpapier over in een LoBind-buis van twee milliliter voor extractie en bewaar het bij 20 graden Celsius. Zorg ervoor dat alle botfragmenten en zoveel mogelijk poeder worden teruggewonnen voordat u een folie weggooit. Ontsmet het werkgebied en bereid u voor op monsterverzameling, zoals eerder beschreven.

Plaats een klein vel weegpapier in een standaard weeglade. Houd de taluskoepel omhoog en het mediale oppervlak naar de collector, boven de weegschaal. Schraap corticale bot tot een diepte van ongeveer een millimeter van de hals van de talus met behulp van een tandboor met een low-gauge bit ingesteld op lage snelheid en hoog koppel.

Verander de boorpositie en herhaal dit totdat ongeveer 50 tot 100 milligram botpoeder is verzameld. Breng dit botpoeder van het weegpapier over in een LoBind-buis van twee milliliter voor extractie. Bewaar het poeder voor onbepaalde tijd bij 20 graden Celsius.

Bewaar het resterende bot en overtollig poeder in een droge, temperatuurgecontroleerde steriele omgeving bij 25 graden Celsius. Gooi al het afval weg in biohazardzakken of recipiënten van de autoclaaf. Steriliseer of ontsmet alle herbruikbare apparatuur en stel deze tussen elke bemonstering bloot aan UV.

De Pars petrosa leverde een hoger endogeen DNA op dan de andere 23 onderzochte anatomische bemonsteringslocaties. De zeven extra anatomische bemonsteringslocaties die in dit protocol worden gepresenteerd, leverden de op een na hoogste opbrengsten op. De alternatieve locaties produceerden consequent DNA-opbrengsten die voldoende waren voor standaard populatiegenetische analyses.

Duplicatiepercentages in bibliotheken afkomstig van alle anatomische bemonsteringslocaties waren laag, wat wijst op een hoge complexiteit. De tanden, evenals thoracale wervels vertoonden voldoende moleculair herstel. Een van de meest uitdagende aspecten van botbemonstering is het boorproces, zoals hoe een boor te houden, waar te boren en wanneer te stoppen met boren.