Efficiënte en kosteneffectieve elektroporatiemethode om primaire ciliumafhankelijke signaalroutes in de granulaatcelprecursor te bestuderen
30 november 2021
Hier presenteren we een reproduceerbaar in vitro elektroporatieprotocol voor genetische manipulatie van primaire cerebellaire korrelcelprecursoren (GCP's) dat kosteneffectief, efficiënt en levensvatbaar is. Bovendien demonstreert dit protocol ook een eenvoudige methode voor de moleculaire studie van primaire cilium-afhankelijke egelsignaleringsroutes in primaire GCP-cellen.
Dit protocol demonstreert een eenvoudige in vitro genetische modificatiemethode voor de moleculaire studie van de primaire ciliumafhankelijke signaalroute in de primaire korrelcelvoorloperculturen. Vanwege de kosten, lage levensvatbaarheid en slechte efficiëntie van de huidige transfectiemethode, introduceren we een eenvoudige, kosteneffectieve en efficiënte elektroporatietechniek voor het onderzoeken van ciliumafhankelijke signaleringsroute in primaire GCP-culturen. Voeg om te beginnen 0,5 milliliter kweekmedium toe aan elke put van de 24-put cultuurplaat met gecoate afdekslips en houd het warm bij 37 graden Celsius in een kooldioxide-incubator.
Pipetteer het vereiste aantal cellen in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en draai gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op 200x G. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel in 200 microliter Opti-MEM. Herhaal deze procedure tweemaal om ervoor te zorgen dat er geen restkweekmedium in de buis aanwezig is.
Stel de parameters van elektroporatie in zoals vermeld. Pipetteer de elektroporatiereactie voorzichtig om goed te mengen en gebruik een lange P200-pipetpunt om een exact volume van 100 microliter van het mengsel over te brengen in de twee millimeter gap cuvette. Zodra de cuvette zich in de cuvettekamer bevindt, drukt u op de omega-knop van de elektroporator en noteert u de impedantiewaarde door vast te houden aan een nauwkeurig volume van 100 microliter.
Het bereik van de impedantiewaarde moet ongeveer 30 en 35 zijn. Druk op de startknop om de puls te starten. Noteer de gemeten stroomwaarden in Joules die op het leesframe worden weergegeven.
Haal de cuvette uit de kamer. Voeg onmiddellijk 100 microliter voorverwarmd kweekmedium toe aan de cuvette en resuspendeerde deze door twee tot drie keer op en neer te pipetteren. Breng de celsuspensie onmiddellijk over naar de eerder bereide 24-putplaat.
Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een kooldioxide-incubator. Observeer de cellen onder de fluorescentiemicroscoop de volgende dag. In de huidige studie leek de elektroporatie-efficiëntie van dmso- en sag-behandelde groepen vergelijkbaar.
Immunostaining van de primaire ciliummarker Arl13b toont aan dat de ciliatiesnelheid van GCP bij div-2 van cultuur in zowel de met het medium als met SAG behandelde groepen. De ciliatiesnelheid illustreert het percentage Pax6 dat GCP's tot expressie brengt met een primair cilium op het celoppervlak bij div-2 post-elektroporatie. De figuur toont een significante toename van afgevlakte EGFP-lokalisatie op het primaire cilium axoneme van Pax6-expressie GCP-cellen 24 uur na SAG-behandeling, wat wijst op een diepgaande activering van de primaire ciliumafhankelijke egelsignaleringsroute.
Om een hogere elektroporatie-efficiëntie te bereiken, moet men zorgen voor een hoge zuiverheid van het gebruikte plasmide en is er geen residucultuurmedium aanwezig in het plasmidelektroporatiemengsel. Dit protocol moet rechtstreeks toepasbaar en gunstig zijn voor in vitro genetische modificatie-experimenten op primaire culturen en celtypen die moeilijk te transfecteren zijn, met inbegrip van neuronen en door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een reproduceerbaar in vitro elektroporatieprotocol dat is ontworpen voor de genetische manipulatie van primaire cerebellaire granulecel voorlopers (GCP's). Het richt zich op een methode die zowel kosteneffectief als efficiënt is voor het bestuderen van de primaire cilia-afhankelijke Hedgehog signaleringsroutes.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Genetische manipulatie
- Celsignalering
Achtergrond
- Primaire cerebellaire granulecel voorlopers (GCP's) zijn cruciaal voor het bestuderen van neurale ontwikkeling.
- Huidige transfectiemethoden zijn vaak inefficiënt en kostbaar.
- De primaire cilia is essentieel voor verschillende signaleringsroutes, inclusief Hedgehog signalering.
- Elektroporatie biedt een potentiële oplossing voor deze uitdagingen.
Doel van studie
- Om een efficiënte elektroporatietechniek voor GCP-kweek te introduceren.
- Om het onderzoek naar primaire cilia-afhankelijke signalering te vergemakkelijken.
- Om de resultaten van genetische manipulatie te verbeteren bij moeilijk te transfecteren celtypen.
Gebruikte methoden
- Het experiment maakte gebruik van in vitro culturen van primaire GCP's.
- Het elektroporatieprotocol omvatte specifieke parameters voor effectieve genetische modificatie.
- Er werd geen multiomics-aanpak vermeld in de studie.
- Kritische stappen omvatten celresuspendering en elektroporatiesequentie.
- Immunostaning werd gebruikt om ciliatiepercentages en activering van signaleringsroutes te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol toonde een significante toename in de activering van de Hedgehog signaleringsroute in behandelde GCP's.
- Immunostaning onthulde een opmerkelijke toename in ciliatiepercentage bij GCP's na elektroporatie.
- De studie gaf inzicht in de efficiëntie van elektroporatie in vergelijking met traditionele methoden.
- Het concludeerde dat hoge plasmide-zuiverheid cruciaal is voor het succes van elektroporatie.
Conclusies
- Deze studie presenteert een waardevol protocol voor genetische manipulatie in primaire GCP's.
- De bevindingen verhogen het begrip van primaire cilia-afhankelijke signaalmechanismen.
- Toekomstige toepassingen kunnen verschillende celtypen omvatten die moeilijk genetisch te manipuleren zijn.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient genetic manipulation of primary granule cell precursors (GCPs) is essential for elucidating cilium-dependent signaling mechanisms that underpin neurodevelopmental and disease pathways. This electroporation protocol delivers high transfection efficiency and cell viability, enabling robust interrogation of Hedgehog pathway dynamics in disease-relevant systems. The method supports predictive confidence in early discovery and target validation for signaling pathway modulators.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional genetic interrogation of cilium-dependent Hedgehog signaling in primary GCPs.
- Supports mechanistic de-risking by allowing direct visualization of pathway component localization.
- Facilitates target validation through reproducible manipulation of signaling nodes in disease-relevant cells.
Screening & Assay Development
- Prepares validated primary cell systems for downstream screening of pathway modulators.
- Delivers high transfection efficiency (~80-90%) and reproducibility for quantitative assay outputs.
- Enables scalable and cost-effective assay development for difficult-to-transfect neuronal models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant cellular phenotypes for translational continuity.
- Supports biomarker discovery by enabling dynamic tracking of signaling protein localization.
- Reduces biological risk in preclinical advancement by providing robust mechanistic data.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the early discovery and target validation stages, bridging genetic manipulation with quantitative pathway analysis in primary neuronal systems.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification in primary GCPs.
- Screening: Provides reproducible, high-efficiency transfection for assay readiness and quantitative readouts.
- Analytics: Enables measurement of ciliation rates and pathway activation via immunostaining and fluorescence microscopy.
- Translational Research: Connects in vitro mechanistic insights to disease-relevant cellular contexts.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable platform for genetic modification in challenging primary cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pathway studies.
- Operational Value: Standardizes genetic manipulation with high reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of signaling pathway targets and modulators.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary neuronal culture and electroporation techniques.
- Needs access to electroporation instrumentation and fluorescence microscopy for analysis.
- Demands cross-team standardization of plasmid purity and media removal protocols.
- Adaptable to other difficult-to-transfect primary cell types with protocol optimization.
- Efficiency depends on precise control of electroporation parameters and sample preparation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Day In Vitro (DIV) 0: Electroporation for Overexpression of Hedgehog Receptor: pEGFP-Smo
2:28
Results: Assessment of Overexpression Efficiency and the Effects of SAG Treatment on Primary Cilium-Dependent Hedgehog Signaling Pathway
3:23
Conclusion
