Efficiënte en kosteneffectieve elektroporatiemethode om primaire ciliumafhankelijke signaalroutes in de granulaatcelprecursor te bestuderen

Dit protocol demonstreert een eenvoudige in vitro genetische modificatiemethode voor de moleculaire studie van de primaire ciliumafhankelijke signaalroute in de primaire korrelcelvoorloperculturen. Vanwege de kosten, lage levensvatbaarheid en slechte efficiëntie van de huidige transfectiemethode, introduceren we een eenvoudige, kosteneffectieve en efficiënte elektroporatietechniek voor het onderzoeken van ciliumafhankelijke signaleringsroute in primaire GCP-culturen. Voeg om te beginnen 0,5 milliliter kweekmedium toe aan elke put van de 24-put cultuurplaat met gecoate afdekslips en houd het warm bij 37 graden Celsius in een kooldioxide-incubator.

Pipetteer het vereiste aantal cellen in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en draai gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op 200x G. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel in 200 microliter Opti-MEM. Herhaal deze procedure tweemaal om ervoor te zorgen dat er geen restkweekmedium in de buis aanwezig is.

Stel de parameters van elektroporatie in zoals vermeld. Pipetteer de elektroporatiereactie voorzichtig om goed te mengen en gebruik een lange P200-pipetpunt om een exact volume van 100 microliter van het mengsel over te brengen in de twee millimeter gap cuvette. Zodra de cuvette zich in de cuvettekamer bevindt, drukt u op de omega-knop van de elektroporator en noteert u de impedantiewaarde door vast te houden aan een nauwkeurig volume van 100 microliter.

Het bereik van de impedantiewaarde moet ongeveer 30 en 35 zijn. Druk op de startknop om de puls te starten. Noteer de gemeten stroomwaarden in Joules die op het leesframe worden weergegeven.

Haal de cuvette uit de kamer. Voeg onmiddellijk 100 microliter voorverwarmd kweekmedium toe aan de cuvette en resuspendeerde deze door twee tot drie keer op en neer te pipetteren. Breng de celsuspensie onmiddellijk over naar de eerder bereide 24-putplaat.

Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een kooldioxide-incubator. Observeer de cellen onder de fluorescentiemicroscoop de volgende dag. In de huidige studie leek de elektroporatie-efficiëntie van dmso- en sag-behandelde groepen vergelijkbaar.

Immunostaining van de primaire ciliummarker Arl13b toont aan dat de ciliatiesnelheid van GCP bij div-2 van cultuur in zowel de met het medium als met SAG behandelde groepen. De ciliatiesnelheid illustreert het percentage Pax6 dat GCP's tot expressie brengt met een primair cilium op het celoppervlak bij div-2 post-elektroporatie. De figuur toont een significante toename van afgevlakte EGFP-lokalisatie op het primaire cilium axoneme van Pax6-expressie GCP-cellen 24 uur na SAG-behandeling, wat wijst op een diepgaande activering van de primaire ciliumafhankelijke egelsignaleringsroute.

Om een hogere elektroporatie-efficiëntie te bereiken, moet men zorgen voor een hoge zuiverheid van het gebruikte plasmide en is er geen residucultuurmedium aanwezig in het plasmidelektroporatiemengsel. Dit protocol moet rechtstreeks toepasbaar en gunstig zijn voor in vitro genetische modificatie-experimenten op primaire culturen en celtypen die moeilijk te transfecteren zijn, met inbegrip van neuronen en door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen.