Generatie van Haak Ischemie-Reperfusie Model met behulp van een driedaagse ontwikkelende kuiken embryo

Hallo, ik ben Dr.Syed Shadab Raza, de hoofdonderzoeker voor het Laboratorium voor Stamcellen en Herstellende Neurologie, gevestigd aan de afdeling Biotechnologie aan de Era University Campus, Lucknow, India. In mijn laboratorium streven we ernaar om het pathofysiologische mechanisme te begrijpen dat ten grondslag ligt aan ischemie-reperfusiestoornissen en de interventies die deze processen kunnen omkeren. In deze context gebruiken we vaak het in vitro en het in vivo model van ischemische beroerte.

Onlangs hebben we een ischemisch-reperfusieletselmodel gemaakt in een drie dagen ontwikkelend kuikenembryo. Dus nu gaan mijn studenten je laten zien hoe je de ischemie-reperfusie-verwonding kunt repliceren in een drie dagen ontwikkelend kuikenembryo. Nu gaan we je laten zien hoe je ischemie-reperfusie kunt creëren in een drie dagen durend kuikenembryo.

Ons model is kosteneffectief, tijdbesparend en zeer reproduceerbaar. Dus laten we beginnen. Dag één.

Vereisten voor de eerste dag. Procedure. Reinig het zero day ei met 70% ethanol met papieren doekjes. Schrijf vervolgens de huidige dag, datum, op eieren met OHP-marker en plaats de eieren vervolgens in een eierincubator met een temperatuur van 36 tot 37 graden Celsius en 60 tot 65% luchtvochtigheid.

Broed de eieren de komende 24 uur uit. Dag twee. Vereisten voor de tweede dag. Procedure.

Veeg de chirurgische schaar af met 70% ethanol of gevolgd door een autoclaaf. Verwijder na 24 uur incubatie het ei uit de incubator voor gelaagdheid. Bevestig vervolgens een klein stukje Sellotape van ongeveer een centimeter lengte en breedte aan de rand van het ei en maak vervolgens een klein gaatje in de rand van de eierschaal met behulp van de scherppuntige randschaar gevolgd door het inbrengen van een spuit van vijf ml in een hoek van ongeveer 75 graden.

Nadat u de naald in de dooierzak hebt ingebracht, trekt u langzaam vijf tot zes ml albumine terug. Na het verwijderen van de albumine, hersluit het gat met Sellotape en plaats het ei terug in de 37 graden Celsius ei incubator voor de komende 48 uur. Dag vier.

Vereisten voor de vierde dag. Procedure. Bereid de Ringer's oplossing, 0,9% normale zoutoplossing en één X fosfaatbufferzoutoplossing volgens de tabellen in dit manuscript. Autoclaaf vervolgens de drie oplossingen.

Na de autoclaaf kunnen de respectieve oplossingen op kamertemperatuur worden geplaatst. Haal vervolgens het ei uit de 37 graden eierincuse. Bedek nu, voordat u de schaal snijdt, het gebied van vensters met Sellotape.

En maak nu een klein gaatje op de eierschaal en begin met het snijden van een cirkelvormige opening. Dit proces staat bekend als windowing. Zorg ervoor dat de cirkelvormige snede groot genoeg is, zodat het embryo gemakkelijk vanuit elke richting toegankelijk is, omdat de positionering van het ei mogelijk moet worden aangepast aan de positie van het embryo.

Zoek nu met behulp van een stereo zoom chirurgische microscoop de juiste vitalline slagader of RVA. Hier geeft de pijl het driedaagse ontwikkelingsstadium van het embryo aan. Zodra de RVA is gelokaliseerd, maak je met behulp van een naald van 26 G twee kleine gaatjes aan de linker- en rechterkant van de RVA.

Pas vervolgens de Doppler-bloedstroombeeldvormingsonde aan op de RVA. De Doppler-sonde voor beeldvorming van de bloedstroom moet vijf plus minus één millimeter van de plaats van ischemie en tweederde van het distale uiteinde van de RVA worden geplaatst. Neem fluxmeting gedurende 30 seconden tot twee minuten, zoals gewenst.

Dit zal de normoxie fase meting maken. Vorm nu handmatig de rand van de spinale naald om de rand een vorm van haak te geven met behulp van een neustang gevolgd door een tandentang. Breng nu met behulp van een micromanipulator de spinale naald net onder de juiste vitalline-slagader in.

U bent klaar om de spinale naald op te tillen. Til nu met behulp van de micromanipulator langzaam de slagader op totdat de Doppler-bloedstroomflux een minimale afname van 80% in de arteriële stroom vertoont. Zodra een daling van 80% of meer in dopplerflux is bereikt, laat u de spinale naald omhoog tillen en trekt u de slagader gedurende vijf minuten.

Dit zal de periode van ischemie zijn. Na deze ischemische timing van vijf minuten, laat u de slagader langzaam los met behulp van een micromanipulator om de normale bloedstroomniveaus te herstellen. Nu zou de Doppler-bloedstroommeter metingen moeten laten zien die vergelijkbaar zijn met die waargenomen tijdens normoxie.

Dit wordt de periode van reperfusie in de RVA. Breng na het I / R-proces twee, drie druppels 1X PBS aan op het embryo. Sluit ten slotte het venster opnieuw met Sellotape en plaats het ei vervolgens vijf uur en 55 minuten terug in de eierincuse.

Haal na vijf uur en 55 minuten het ei uit de eierincuse en leg het op de eierschaal en open het raam. Behandelingsvereisten. Procedure. Voor de behandeling van de slagaders met de geneesmiddelen, activatoren of remmers moet de RVA na één uur I/R-proces worden weggesneden.

Haal het embryo uit de schaal door het uit de schaal te halen op een steriele petrischaal van 100 mm. Zodra het embryo in de petrischaal is vrijgegeven, snijdt u de RVA met behulp van oculaire iris in de begeleiding van stereo zoom chirurgische microscoop. De excisiemaat van RVA moet maximaal 15 plus minus één millimeter distaal van de stam zijn en twee plus min één millimeter naar de stam.

Na het uitzrijgen van de RVA, wast u deze met 1X PBS in een nieuwe, steriele petrischaal. Voor de gewenste behandelingen, doe de slagader in een gesteriliseerde 1,5 milliliter centrifugebuis gevuld met 500 microliter Ringer's oplossing. En nadat je de slagader in de centrifugebuis hebt geplaatst, zet je deze vijf uur in de laboratoriumincubator van 37 graden Celsius.

Haal na vijf uur incubatie de RVA uit de 37 graden Celsius laboratoriumincubator en ga verder voor de gewenste behandelingen. En nu, om de resultaten te presenteren. Om het nut van ons model in ischemisch-reperfusieonderzoek in ischemische slagaders te verifiëren, hebben we eerst gekeken naar de activiteiten van zuurstofregulerende eiwitten 150 of ORP150, cytoplasmatisch superoxide dismutase één of SOD1 en katatase.

De met I/R behandelde RVA's vertoonden een verhoogde activiteit van ORP150, cytoplasmatische SOD1 en catalase in vergelijking met de controlegroep, maar door aan te vullen met N-acetyl-L-cysteïne, of NAC, een ROS-quencher, verminderde oxidatieve stress in de I/R-groep, zoals blijkt uit de huidige figuur. Om het nut van dit model voor inflammatoire onderzoeken vast te stellen, hebben we gekeken naar de expressie van I/R-1 bèta en TNF-alfa in I/R-behandelde RVA's versus controle-RVAs. Beide interleukines bleken overexpressie te hebben in de Hook-I/R-groep in vergelijking met de controlegroep.

De suppletie van Naringenin, een ontstekingsremmend medicijn, verminderde de niveaus van IL1-bèta en TNF-alfa aanzienlijk. Vervolgens onderzochten we de expressie van NLRP3 en NF-kappa beta door middel van Western blotting. Deze analyse ontdekte bewijs van activering van het NLRP3-inflamsoom, evenals NF-kappa bèta als reactie op I/R geproduceerd in de RVA.

Net als bij eerdere resultaten verminderde Naringenine de expressie van NLRP3 en NF-kappa beta. Deze resultaten toonden aan dat ons model kon worden gebruikt om ontstekingsveranderingen te onderzoeken. Vervolgens onderzochten we het effect van I/R op apoptose en autofagiebanen.

Eerst, in figuur A, kregen we toegang tot de uitdrukking van gekloofde caspase-3. We zagen een verbeterde expressie van gekloofd caspase-3 in de I/R-groep in vergelijking met de controlegroep, terwijl de I/R-groep die ZVADFMK kreeg een afname van de expressie van caspase-3 vertoonde. Evenzo vertoonde de I / R-groep hoge eiwitniveaus van LC3, autofagosoommarker Beclin-1, een belangrijke regulator van autofagie in zoogdiercellen, en ATG-7, een eiwit dat nodig is voor basale autofagie, dan de controlegroep, terwijl de groepen die 3-ma, een autofagieremmer, ontvingen, een afname vertoonden in de expressie van de bovenstaande drie autofagie-eiwitten, zoals blijkt uit de figuren B tot en met D.De figuur E toont het effect van Hook-gemedieerde I/R op ambra-1 en ATG-7 mRNA niveaus.

Deze resultaten waren in lijn met de vorige resultaten, dat wil zeggen dat verbeterde mRNA-expressie werd waargenomen voor ambra-1 en ATG-7 in met I/ R behandelde RVAs in vergelijking met hun respectieve controles. De uitkomsten werden echter omgekeerd wanneer 3-ma werd toegevoegd aan de I / R-groep. Het huidige cijfer geeft de effectiviteit van ons model weer om de veranderingen in het DNA te bestuderen.

We zagen een intens DNA-uitstrijkje in de met I/R behandelde groep in vergelijking met de controlegroep. De aanvulling van NAC op de RVA-groep draaide de uitkomst echter om. Om te onderzoeken hoe effectief ons model is in tegenstelling tot andere modellen, hebben we de gegevens die door ons Hook-I/R-model worden gegenereerd vergeleken met het MCAO-model in dit experiment.

Kortom, de expressie van het apoptotische eiwit, gekloofde caspase-3, de autofagie-eiwitten, Beclin-1 en ATG-7, en de inflammatoire interleukines, TNF en IFN, was gebonden hoger in I / R-behandelde RVAs dan in controle RVAs. Interessant is dat het Hook-I / R-model resultaten gaf die sterk leken op die verkregen door het MCAO-model, of het nu de analyse was voor inflammatoire stress of cellulaire doodsroutes. Ons model kan worden gebruikt voor routinematige ischemie-reperfusie-experimenten, alleen of parallel aan de bestaande modellen.

Tijdens het nabootsen van de ischemie-reperfusie moet echter een hoogste voorzorgsmaatregel worden genomen bij het maken van gaten, rechts en links van de RVA, en ook bij het afsluiten of vrijgeven van de RVA, zodat deze geen slagaders of aderen mag beschadigen. In routinematige moleculaire biologie zoals Western blotting, QRT-PCR-analyzer, chemische zuren en beeldvormingstechnieken kunnen worden geïmproviseerd om pathofysiologie geassocieerd met de ischemie-reperfusie te associëren in een drie dagen ontwikkelend kuikenembryo. Dit model kan efficiënt worden gebruikt om moleculaire mechanica op DNA-, RNA- en eiwitniveau te bestuderen.

Zoals we u hebben laten zien, de I / R-modellering in een driedaags ontwikkelend kuikenembryo, geloven we dat ons model nieuwe wegen zal openen op het gebied van I / R-onderzoek. Met dit werk wens ik je het allerbeste voor je experimenten. Bedankt.