Een microfysiologisch systeem om leukocyten-endotheelcelinteractie tijdens ontsteking te bestuderen

Leukocyten-endotheelcelinteracties spelen een belangrijke rol bij ontstekingsziekten zoals sepsis. Ontstekingsontregeling veroorzaakt vaak een veranderde vasculaire endotheelbarrièrefunctie en overmatige leukocytenhandel, wat kan leiden tot orgaanschade. De biomimetische microfluïdische assay, wat we bMFA noemen, reproduceert topografie en stromingsomstandigheden van in-vivo microvasculaire netwerken en maakt realtime beoordeling mogelijk van rollende, stevige adhesie, verspreiding en migratie van neutrofielen in het weefselcompartiment.

Een kracht van de biomimetische microfluïdische test is het vermogen om primaire menselijke cellen en klinisch relevante patiëntmonsters te gebruiken om de klinische vertaling te verhogen en potentiële therapieën snel te screenen. De procedures worden gedemonstreerd door Mr.Qingliang Yang, een afgestudeerde onderzoeksassistent van mijn laboratorium. Begin met het inbrengen van de buis van ongeveer een centimeter lengte in de poorten met behulp van een fijne tang, op één inlaatpoort na.

Klem met behulp van kaakklemmen de twee uitlaatpoorten en het weefselcompartiment samen. Verdun de fibronectine-stamoplossing tot 100 microgram per milliliter met PBS. Laad een spuit van één milliliter die is aangesloten op een stompe naald van 24 gauge met de verdunde fibronectine-oplossing en sluit de spuit aan op een vier centimeter lange slang.

Steek de slang in de open inlaatpoort, duw vervolgens op de zuiger totdat humaan fibronectine vrijkomt uit een andere inlaatpoort en klem deze vast. Herhaal het proces voor de resterende poorten totdat alle kanalen, weefselcompartiment en slangen zijn gevuld met de menselijke fibronectine-oplossing. Verwijder de naald, maar houd de vier inch lange slang ingebracht en ongecensureerd.

Om ontgassing uit te voeren, sluit u de niet-verlichte buis aan op de pneumatische primer die is aangesloten op een gecomprimeerde stikstoftank met een druk van vijf pond per vierkante inch gedurende 15 minuten. Controleer onder de microscoop of er geen luchtbellen in het kanaal of weefselcompartiment zijn opgesloten en sluit het apparaat opnieuw aan als de luchtbellen aanwezig zijn. Verwijder het apparaat uit de pneumatische primer en incubeer het gedurende een uur bij 37 graden Celsius.

Met behulp van voorverwarmde humane longmicrovasculaire endotheelcelkweekmedia, spoel alle kanalen en het weefselcompartiment. Na het oogsten van de endotheelcellen zoals beschreven in het teksthandschrift, pelleteert u de cellen door centrifugeren gedurende vijf minuten op 150 keer G.In de programmeerbare spuitpomp, monteert u een spuit van één milliliter en bevestigt u de slang aan de stompe naald. Trek ongeveer 20 microliter van de celsuspensie in de slang zonder deze in de spuitcilinder te laten.

Verwijder de klem uit de uitlaatpoort van het apparaat. Sluit de slang aan op de inlaatpoort zonder een luchtbel in het kanaal te brengen. Stop de pomp met een debiet van vier tot acht microliter per minuut en observeer onder de microscoop.

Stop de pomp wanneer de kanalen gevuld zijn met cellen. Klem de uitlaat vast en knip de inlaatbuis. Plaats het apparaat vier uur in de couveuse bij 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius.

Na vier uur incubatie, bereid een andere spuit en vul deze met verse celkweekmedia. Monteer de spuit in een spuitpomp en sluit deze aan op de inlaatpoort. Verwijder de klem uit de uitlaatpoort.

Laat de verse media ongeveer vijf minuten met vier tot acht microliter per minuut door het apparaat lopen om de zwevende of niet-losgemaakte cellen te verwijderen. Bereid een spuit voor door deze te vullen met verse celkweekmedia. Monteer de spuit in een spuitpomp en sluit deze aan op één inlaatpoort terwijl de uitlaatpoort open blijft.

Plaats het apparaat in een incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Programmeer de spuitpomp voor het kweken van endotheelcellen onder stroom zoals beschreven in het tekstmanuscript. Controleer met behulp van een microscoop bMFA na 48 uur cultuur onder stroom.

Confocale microscopie gaf aan dat alle oppervlakken van de vasculaire kanalen bedekt waren door endotheelcellen, die een volledig 3D-lumen vormden in bMFA. Na het bereiden van drie verschillende bMFA-apparaten, laadt u drie spuiten van één milliliter met celkweekmedia of TNF-alfa of TNF-alfa in combinatie met pkc-deltaremmer respectievelijk, waarbij TNF-alfa en inflammatoir cytokine wordt gebruikt om endotheelcellen en neutrofielen te stimuleren. PKC delta inhibitor is een nieuwe ontstekingsremmer.

Sluit de drie geladen spuiten aan op drie bMFA-apparaten. Gebruik buffer TNF-alfa of TNF-alfa met toegevoegde remmer, behandel menselijke longmicrovasculaire endotheelcellen gedurende vier uur met 0,1 microliter per minuut. Na het isoleren van de menselijke neutrofielen zoals beschreven in het teksthandschrift, resuspendeert u de neutrofielen in 999 microliter HEPES-buffer en voegt u één microliter 10-millimolaire CFDA SE-kleurstofvoorraadoplossing toe aan de suspensie, wat resulteert in een 10-micromolaire werkoplossing van CFDA SE en incubeer deze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Was de cellen tweemaal met hepes-buffer door de oplossing gedurende vijf minuten te centrifugeren op 315 maal G.Na het tellen van de cellen, resuspend met 2 miljoen neutrofielen per milliliter in celkweekmedia of TNF-alfa of TNF-alfa toegevoegd met PKC deltaremmer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Vul de spuit met één micromolair van een chemo-lokstof, fMLP, bereid in celkweekmedia. Open één inlaat en één uitlaatpoort van de bMFA.

Verwijder de poortslang uit het weefselcompartiment en plaats de fMLP-slang. Injecteer ongeveer 20 microliter fMLP in het weefselcompartiment voor alle bMFA, waarbij degene die wordt behandeld met celkweekmedia. Knip de slang af en klem deze vast.

Vul de spuit met ongeveer 200 microliter neutrofielensuspensie en monteer de spuit op de spuitpomp. Nadat u het apparaat op een omgekeerd microscooptrap hebt geplaatst, stelt u het debiet in op één microliter per minuut en start u de pomp. Wacht tot een kleine druppel van de neutrofielensuspensie uit de slang komt en steek de slang in de inlaatpoort.

Fluorescerend gelabelde neutrofielen stromen in de vasculaire kanalen en interageren met endotheelcellen en de fysiologisch relevante stroomomstandigheden. Na 10 minuten na het starten van het experiment opent u de beeldanalysesoftware, schakelt u de objectieflens naar 10x en gebruikt u de podiumjoystick om het apparaat onder de microscoop te centreren. Als u de hechtingstoewijzing wilt ophalen, gaat u naar Verwerven en klikt u op Grote afbeelding scannen.

Er verschijnt een nieuw venster. Kies 10x Objectief lens en stel de veldoptie in, bijvoorbeeld 5 bij 3. Klik op Scannen, klik op Bestand en sla de hechtingskaart op.

Om de migratiekaart voor migratieanalyse te verkrijgen, centreert u het apparaat onder de microscoop met behulp van de podiumjoystick. Klik op Weergave, Acquisitiecontroles, ND-acquisitie. Er verschijnt een nieuw venster.

Stel het pad in om het bestand op te slaan en typ de bestandsnaam. Controleer de functie Grote afbeelding, stel Scangebied in, bijvoorbeeld 5 bij 3. Controleer de functie Tijd, stel het interval in op vijf minuten en de duur op 60 minuten.

Maak timelapse-afbeeldingen van het weefselcompartiment, waarbij het volgende uur elke vijf minuten één foto wordt gemaakt. CFD-simulatie toont het laminaire stromingspatroon in vasculaire kanalen, behalve voor bifurcatiegebieden waar het stromingspatroon verstoord is. Na het uitvoeren van de biomimetische microfluïdetest, onthulden fasecontrastbeelden dat de oppervlakken van de vasculaire kanalen bedekt waren met endotheelcellen en uitgelijnd in de richting van de schuifstroom na 48 uur cultuur.

Fluorescentiebeeldvorming werd uitgevoerd met behulp van confocale microscopie, wat aangeeft dat de endotheelcellen een volledig driedimensionaal lumen vormen in bMFA Een neutrofiele adhesiekaart werd verkregen, waaruit bleek dat er een significante hechting van neutrofielen aan endotheelcellen in bMFA is. Neutrofielenmigratiekaart in bMFA toonde aan dat bij TNF-alfa-activering een aanzienlijke migratie van neutrofielen optreedt in het weefselcompartiment, terwijl een dergelijke migratie niet werd waargenomen zonder TNF-alfa-activering. Een adhesiekaart die de ruimtelijke verdeling van neutrofielen correleerde met de afschuifsnelheid toonde aan dat neutrofielenadhesie bij voorkeur optrad in vaten met een lage afschuifsnelheid en in de buurt van bifurcatiegebieden.

Verder verhoogt TNF-alfabehandeling de hechting aanzienlijk, die werd geremd met de PKC-deltaremmer. Het analyseren van timelapse-beelden gaf aan dat TNF-activering van endotheelcellen de neutrofielenmigratie verhoogt als reactie op fMLP, terwijl behandeling met de PKC-deltaremmer de migratie verminderde in vergelijking met met TNF-alfa behandelde cellen. Zo kan bMFA worden gebruikt om de werkzaamheid van een nieuw therapeutisch middel voor de behandeling van ontstekingsziekten te testen.

De bMFA kan ook worden gebruikt om de endotheelintegriteit te bestuderen door variabelen te meten zoals permeabiliteit en trans-endotheel elektrische weerstand, wat TEER wordt genoemd, en adhesiemolecuulexpressie tijdens ontsteking. De biomimetische microfluïdische test kan de micro-omgeving van verschillende organen nabootsen en is niet beperkt tot enkele celtypen of soorten, en kan ook cel / celcommunicatie modelleren die cruciaal is voor de orgaanfunctie en het modelleren van verschillende ziekten.