Beoordeling van mitochondriale functie in heupzenuw door middel van hoge resolutie respirometrie

Dit protocol maakt de evaluatie van de mitochondriale functie in de zenuw mogelijk door verkaveling van de geïsoleerde mitochondriën, een uitdagende procedure in een klein weefsel dat een beperkt aantal mitochondriën bevat. De techniek biedt de mogelijkheid om mitochondriale functies zoals zuurstofverbruik en ROS-productie gelijktijdig te analyseren in een bewaard gebleven mitochondriën in situ. Met meerdere substraten, remmers en uncoupler-ontwerpprotocollen.

Verschillende ziekten delen de mitochondriale functie, met name neuropathieën veroorzaakt door diabetes type twee of chemotherapie. Bij deze ziekten is een aantasting van mitochondriale oxidatieve fosforylering het enige teken dat de ontwikkeling van ziekten dicteert. Deze methode biedt inzicht in neurobiologie, biochemie en farmacologie, met het onderzoek van mitochondriale ziektemechanismen, het zoeken naar therapieën, zoals mitochondriale boosters of verbeterde neuropathische pijn.

Kalibreer om te beginnen de zuurstofsensoren door 2,1 milliliter MR-buffer in elke kamer te pipetteren. Sluit het met de stoppers en zuig lucht in de kamer totdat er een bel is gevormd. Roer gedurende een uur in de kalibratiemodus op 37 graden Celsius totdat de zuurstofflux per massa stabiliseert.

Voer met behulp van de HRR-software een luchtkalibratie uit van de polarografische zuurstofsensoren volgens de instructies van de fabrikant. Plaats voor weefselvoorbereiding de heupzenuw in een petrischaaltje met voldoende TP-buffer om het te bedekken. Houd het ene uiteinde van de zenuw vast met een tang en trek met een ander paar tangen de zenuwbundels horizontaal uit.

Breng eerst het weergegeven weefsel over in een kleine schaal met één milliliter TP-buffer voor weefselpermeabilisatie. Om permeabilisatie te starten, brengt u het weefsel met een tang over naar een andere schaal met één milliliter TP-buffer, die 50 microgram per milliliter saponine bevat. Plaats het bord in een microplate shaker en laat het 30 minuten zachtjes roeren.

Breng vervolgens het weefsel met een tang over naar een vers gerecht met één milliliter MR-buffer en laat het gedurende 10 minuten voorzichtig roeren. Breng het weefsel met een tang over naar een gekalibreerde HRR-kamer. Vul de HRR-kamers met 2,1 milliliter MR-buffer.

Voeg Amplex Red en peroxidase toe aan een eindconcentratie van respectievelijk vijf micromol en twee eenheden per milliliter. Voeg vervolgens de doorlatende heupzenuw toe. Bevestig de fluorescentiesensoren van het instrument.

Schakel vervolgens de lichten uit in het besturingsgedeelte van de software en klik op verbinden met oxygraph "Ga protocollen bewerken" in de software en plaats het weefselgewicht. Ga naar lay-out en kies de specifieke flux per eenheid monster"optie. Selecteer vervolgens percelen om tegelijkertijd toegang te krijgen tot de uitlezing van het zuurstofverbruik en, indien nodig, de waterstofperoxideproductie.

Wacht ongeveer 10 minuten. Injecteer twee pulsen waterstofperoxide, elk tot een eindconcentratie van 260 micromolair voor kalibratie van de kamer. Injecteer 20 microliter succinaat, een mitochondriaal complex II substraat, om het mitochondriale elektronentransportsysteem te activeren.

Voeg 20 microliter ADP toe om de ATP-synthese te activeren. Voeg achtereenvolgens vijf microliter cytochroom c toe als indicator voor de membraanintegriteit. Titreer met aliquots van 0,2 microgram per milliliter oligomycine totdat er geen verdere afname van het zuurstofverbruik wordt waargenomen.

Titreer met aliquots van 0,5 micromol per liter FCCP, de mitochondriale ontkoppelaar, totdat er geen verdere toename van het zuurstofverbruik wordt waargenomen. Om het experiment te beëindigen, injecteert u twee microliter antimycine A, doet u een eindconcentratie van vijf millimolar en wacht u tot de stroom stabiliseert. Ga naar de opdrachtbalk.

Zoek naar multisensorisch"in de software. Klik op control"en druk vervolgens op bestand opslaan" en verbreek de verbinding. Open het opgeslagen bestand en selecteer de zuurstofflux per massabakken om de resultaten van het experimentele zuurstofverbruik te verkrijgen.

Selecteer handmatig het venster tussen injecties door op de shift plus linkermuisknop te drukken. Ga naar markeringen en selecteer statistieken om de resultaten voor elke injectie van substraten, remmers en ontkoppelingsprotocol te visualiseren. Voer voor waterstofperoxideproductie dezelfde procedure uit met het versterkerhellingspoor.

De afname van het membraanpotentieel bevorderd door ATP-sythase-activiteit versnelde het zuurstofverbruik. De toevoeging van exogene cytochroom C bevorderde slechts minimale stimulatie van de ademhaling, waardoor de mitochondriale buitenmembraanintegriteit voor dit preparaat werd gecertificeerd. Absolute zuurstofstromen werden geregistreerd en slechts een toename van 6,3% in de ademhaling werd waargenomen, wat wijst op een goede kwaliteit van het weefselpreparaat.

Het zuurstofverbruik en de ROS-productie werden gelijktijdig gemeten in aanwezigheid van verschillende substraten die brandstof leveren voor het elektronentransportsysteem. De toevoeging van pyruvaat en malaat voor mitochondriaal complex I verhoogde de ademhaling. En verdere toevoeging van succinaat voor complex II verhoogt ook het zuurstofverbruik.

Daarom konden andere substraten worden getest. De ROS-productie nam ook toe, wat wijst op het lekken van zuurstof uit het elektronentransportsysteem. De toevoeging van adenosinedifosfaat in verzadigingsconcentratie verhoogde het zuurstofverbruik en veroorzaakte atp-vorming en verminderde de ROS-productie.

Oligotitratie daarentegen verminderde het zuurstofverbruik en verhoogde de ROS-productie. Dit suggereerde dat geameteniseerde heupzenuw de standaardrelatie in de mitochondriale fysiologie zou kunnen repliceren. De toevoeging van FCCP en retinon, afgestemd op de verwachte veranderingen in de zuurstofflux, bevestigen dat mitochondriale fysiologie en bio-energetisch profiel bewaard zijn gebleven in de gepermatiseerde heupzenuw.

De belangrijkste stap is om het weefselgedeelte voorzichtig voor te bereiden, ervoor te zorgen dat alle kameropeningen goed worden schoongemaakt. Veranderingen in de mitochondriale functie kunnen te wijten zijn aan disfunctie of een lager mitochondriaal aantal. daarom worden geciteerde synthase-activiteit en mitochondriale DNA-inhoudsbevestiging door PCR aanbevolen.