Name: Moleculaire en immunologische technieken in een genetisch gemanipuleerd muismodel van gastro-intestinale stromale tumor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Leer dissectie- en verwerkingsmethoden voor het Kit V558Δ/+ muismodel van gastro-intestinale stromale tumor. Deze technieken ondersteunen translationeel onderzoek naar immunotherapieën voor GIST.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

KitV558Δ/+ muizen werden genetisch gemanipuleerd en gedeeld door Dr. Peter Besmer10. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01 CA102613 en T32 CA251063.

Alle muizen werden gehuisvest onder pathogeenvrije omstandigheden aan de Universiteit van Pennsylvania volgens nih-richtlijnen en met goedkeuring van de Universiteit van Pennsylvania IACUC. Euthanasie werd uitgevoerd volgens de standaard operationele procedures van de University of Pennsylvania Laboratory Animal Resources.
1. KitV558Δ/+ muizen fokken
<ol><li>Steek de KitV558Δ/+ muizen meer dan 10 keer terug op een C57BL/6J achtergrond met behulp van C57BL/6J muizen. Om dit te doen, fokt u de mannelijke KitV558Δ / + -muizen met vrouwelijke C57BL / 6J-muizen in een verhouding van 1: 2. OPMERKING: Het homozygote KitV558Δ/V558Δ genotype is dodelijk in de baarmoeder. Het is mogelijk om vrouwelijke KitV558Δ/+ muizen te fokken met mannelijke C57BL/6J muizen, maar de worpgrootte is ongeveer de helft van die van vrouwelijke wildtype C57BL/6J muizen. Bovendien produceren vrouwelijke KitV558Δ/+ muizen beperkte nesten na de leeftijd van 4 maanden.</li>
	<li>Genotypeer de pups op de leeftijd van 7-14 dagen door teenknippen om de aanwezigheid van het KitV558Δ/+ genotype te bevestigen. Gebruik de voorwaartse primer: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; verslaggever 1: CCTCGACAACCTTCCA; omgekeerde primer: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; en verslaggever 2: TCTCCTCGACCTTCCA voor genotypering.</li>
</ol>2. KitV558Δ/+ muisbehandeling
<ol><li>Leeftijd en geslacht komen overeen met de KitV558Δ/+muizen voorafgaand aan de behandeling. Gebruik de leeftijds- en geslachtsgematchte muizen in cohorten, omdat tumoren van vrouwelijke KitV558Δ / + -muizen groter zijn dan die bij mannelijke muizen. Behandel de muizen op 8-12 weken oud, waarna tumoren worden vastgesteld (figuur 1).</li>
	<li>Geef tyrosinekinaseremmers oraal of via intraperitoneale (i.p.) injectie; KitV558Δ/+ tumoren zijn gevoelig voor tyrosinekinaseremmers. Geef imatinib in een dosis van 600 mg/l in drinkwater of i.p. injecties van 45 mg/kg tweemaal daags. Meet de gewichtsvermindering van de tumor met behulp van digitale weegschalen na dissectie van de tumor zoals weergegeven in stap 3, wat ongeveer 50% is na 1 week en 80% na 4 weken na behandeling met imatinib (figuur 2).</li>
</ol>3. KitV558Δ/+ muis orgaan oogst
<ol><li>Euthanaseer muizen door CO2 narcose met een stroomsnelheid van 60% kamervolume per minuut. Laat muizen minstens 2 minuten in de kamer nadat de ademhaling is gestopt en voer vervolgens cervicale dislocatie uit om de dood te bevestigen.</li>
	<li>Steriliseer alle instrumenten, draag handschoenen tijdens de procedure en onderhoud een steriel veld. Bereid de huid voor met 70% ethanol. Maak een verticale incisie van 2 cm in het midden met een schaar en ga de buikholte in. Lyseer scherp eventuele intra-abdominale verklevingen.</li>
	<li>Volg de onderstaande stappen om de drainerende mesenteriale lymfeklier te verwijderen.<ol>
<li>Identificeer de blindedarm en til het mesenterium superieur op. Ongeveer halverwege de basis van het colon mesenterium, identificeer de mesenteriale lymfeklier en ontleed deze scherp. De lymfeklier is gebroken wit en ongeveer 0,5 cm x 0,5 cm groot.</li>
		<li>Verdeel lymfeklierweefsel in derden voor eiwitisolatie, histologie en eencellige suspensie, indien nodig. Voor eencellige suspensies plaatst u lymfeklierweefsel in 20 ml serumvrije media (RPMI) en houdt u het ijs aan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor isolatie van de GIST en blindedarm, volgt u de onderstaande stappen.<ol>
<li>De blindedarm in KitV558Δ/+ muizen wordt grotendeels vervangen door een GIST. Deel de ileocolic-overgang zorgvuldig van de basis van de tumor. Om de blindedarm te verzamelen, deelt u de dikke darm opnieuw, 2 cm proximaal aan de basis van de tumor.</li>
		<li>Bij 50%-60% van de KitV558Δ/+ muizen bevat de kop van de tumor een kap van cecal weefsel, die meestal sereuze vloeistof bevat, maar zelden pus kan bevatten (figuur 3). Ontleed het dopweefsel scherp weg van het tumorweefsel.</li>
		<li>Verdeel tumorweefsel en / of blindedarm in derden voor eiwitisolatie, histologie en eencellige suspensie, indien nodig. Voor eencellige suspensies plaatst u tumorweefsel of blindedarm in HBSS met 2% FCS, genoeg om het monster te bedekken en op ijs te houden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Western blot analyse van GIST weefsel
<ol><li>Bereid weefsellysisbuffer met 50 mM TrisHCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% niet-rijpend wasmiddel, 2 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 10 mM NaF en 20 μl/ml proteïnaseremmermengsel.</li>
	<li>Bereid een 1x Tris-gebufferde zoutoplossing met 1% Tween 20 (TBST) door 1800 ml gedeïoniseerd water, 2 ml Tween 20 en 200 ml 10x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) te combineren.</li>
	<li>Resuspensie weefsel uit stap 3.4.3 in een FACS-buis in 5 ml / g weefsellysisbuffer en homogeniseer tweemaal met een mechanische homogenisator bij 15.000 tpm gedurende 15 s op ijs. Incubeer lysaat gedurende 30 minuten op ijs.</li>
	<li>Breng lysaat over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Centrifugeer met maximale snelheid gedurende 20 minuten bij 4 °C. Breng supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis.</li>
	<li>Voer lysaten uit op een 4% tot 15% gradiëntgel en breng vervolgens over naar een nitrocellulosemembraan, zoals beschreven in14.</li>
	<li>Was het membraan eenmaal in 1x TBS gedurende 5 minuten en blokkeer vervolgens het membraan in 5% melk gedurende 1 uur. Nogmaals, was het membraan eenmaal in 1x TBS gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Incubeermembraan in primair antilichaam verdund 1:1000 in 5% BSA bij 4 °C 's nachts. Wasmembraan 3x in 1x TBST gedurende 10 min elk. Incubeervlek met secundair antilichaam verdund 1:2500 in 2,5% melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was het membraan eenmaal in 1x TBS gedurende 5 min. Voeg voldoende HRP-substraat toe om het membraan te bedekken, meestal 200-500 μL, en gebruik een digitale imager om chemiluminescentie te detecteren en te kwantificeren.</li>
</ol>5. Immunohistochemie van GIST-weefsel
<ol><li>Fixeer weefsel uit stap 3.3.2 of 3.4.3 in 4% paraformaldehyde bij 4 °C 's nachts. Bewaar weefsel in 70% EtOH tot het klaar is voor verwerking. Inbouw- en sectieblokken met een dikte van 5 μm op glasplaten, zoals beschreven15,16.</li>
	<li>Volledige immunohistochemische detectie met behulp van een basis immunodetectiekit, zoals eerder beschreven17.</li>
</ol>6. Eencellige suspensie van mesenteriale lymfeklier
<ol><li>Giet RPMI-media met lymfekliermonster uit stap 3.3.2 over een filter van 100 μm. Verplaats het filter naar een nieuwe conische 50 ml en pureer lymfeklier met het zachte uiteinde van een plastic spuit van 3 ml. Wasfilter met 20 ml RPMI-media.</li>
	<li>Centrifugeer het filtraat bij 450 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Aspirateer het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer pellet in 20 ml van 1% FBS in PBS (kraalbuffer) en giet over een filter van 40 μm. Verzamel het celfiltraat. Tel cellen met behulp van een hemocytometer.</li>
	<li>Centrifugeer het filtraat bij 450 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Aspirateer het supernatant. Resuspenderen in kraalbuffer op 6 x 107 cellen/ml voor flowcytometrie.</li>
</ol>7. Eencellige suspensie van GIST
<ol><li>Bereid collagenasebuffer voor door 250 mg collagenase IV, één tablet EDTA-vrije proteaseremmer en 100 μL DNase I toe te voegen aan 50 ml HBSS. Draai gedurende 10 minuten op kamertemperatuur totdat het is opgelost.</li>
	<li>Doe GIST in een steriele schaal en voeg 2,5 ml collagenasebuffer toe. Gehakt tumor met behulp van een steriel scalpel en schaar totdat de tumor in fijne fragmenten is. Gebruik een pipet met grote boring om de tumor en collagenase in een buis van 50 ml te aspirateren.</li>
	<li>Incubeer in een schudincubator bij 100 tpm bij 37 °C gedurende 30 min. Blusreactie met 2 ml FBS.</li>
	<li>Giet collagenase met GIST-monster over een filter van 100 μm en pureer tumor met het zachte uiteinde van een plastic spuit van 3 ml en verzamel in een buis van 50 ml. Wasfilter met 20 ml HBSS. Centrifugeer het filtraat bij 450 x g, 4 °C gedurende 5 min. Aspirateer het supernatant.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 20 ml kraalbuffer en giet over een filter van 40 μm. Verzamel het filtraat en tel cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer het filtraat bij 450 x g, 4 °C gedurende 5 min. Aspirateer het supernatant. Resuspenderen in kraalbuffer op 6 x 107 cellen/ml voor flowcytometrie.</li>
</ol>8. Eencellige suspensie van blindedarm
<ol><li>Bereid collagenasebuffer voor zoals in stap 7.1. Splits met behulp van een schaar de blindedarm in de lengterichting om het binnenste slijmvlies bloot te leggen. Snijd in secties van 0,5 cm en plaats in een buis van 50 ml met 5 ml HBSS met 2% FBS. Schud krachtig gedurende 30 s, centrifugeer op 450 x g gedurende 20 s en adem vervolgens het supernatant op.</li>
	<li>Voeg 5 ml HBSS toe met 2 mM EDTA. Incubeer in een schudinmachine bij 37 °C bij 100 tpm gedurende 15 minuten. Centrifugeer bij 450 x g gedurende 20 s. Aspirateer het supernatant.</li>
	<li>Voeg 5 ml HBSS toe. Schud krachtig gedurende 30 s, centrifugeer op 450 x g gedurende 20 s en adem vervolgens het supernatant op. Herhaal dit nogmaals.</li>
	<li>Voeg 5 ml collagenasebuffer toe. Incubeer in een schudincubator bij 37 °C gedurende 30 min bij 100 tpm. Schud krachtig om de 10 minuten. Blusreactie met 2 ml FBS.</li>
	<li>Giet collagenase met blindedarmmonster over een filter van 100 μm en pureer met het zachte uiteinde van een plastic spuit van 3 ml. Wasfilter met 20 ml HBSS. Filtraat verzamelen.</li>
	<li>Centrifugeer het filtraat bij 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Aspirateer het supernatant. Resuspendeer pellet in 20 ml kraalbuffer en giet over een filter van 40 μm. Verzamel filtraat en tel cellen met behulp van een hemocytometer.</li>
	<li>Centrifugeer het filtraat bij 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Aspirateer het supernatant. Resuspenderen in kraalbuffer op 6 x 107 cellen/ml voor flowcytometrie.</li>
</ol>

<ol><li>Mastrangelo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+soft+tissue+sarcoma+and+beyond%3A+a+population-based+prospective+study+in+3+European+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Incidence of soft tissue sarcoma and beyond: a population-based prospective study in 3 European regions.</a> Cancer. 118 (21), 5339-5348 (2012).</li>
<li>Joensuu, H., DeMatteo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+management+of+gastrointestinal+stromal+tumors%3A+a+model+for+targeted+and+multidisciplinary+therapy+of+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The management of gastrointestinal stromal tumors: a model for targeted and multidisciplinary therapy of malignancy.</a> Annual Review of Medicine. 63, 247-258 (2012).</li>
<li>Blanke, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+results+from+a+randomized+phase+II+trial+of+standard-+versus+higher-dose+imatinib+mesylate+for+patients+with+unresectable+or+metastatic+gastrointestinal+stromal+tumors+expressing+KIT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (4), 620-625 (2008).</li>
<li>Demetri, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+regorafenib+for+advanced+gastrointestinal+stromal+tumours+after+failure+of+imatinib+and+sunitinib+%28GRID%29%3A+an+international%2C+multicentre%2C+randomised%2C+placebo-controlled%2C+phase+3+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial.</a> Lancet. 381 (9863), 295-302 (2013).</li>
<li>Gold, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+metastatic+GIST+in+the+era+before+tyrosine+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Outcome of metastatic GIST in the era before tyrosine kinase inhibitors.</a> Annals of Surgical Oncology. 14 (1), 134-142 (2007).</li>
<li>Huynh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorafenib+induces+growth+suppression+in+mouse+models+of+gastrointestinal+stromal+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Sorafenib induces growth suppression in mouse models of gastrointestinal stromal tumor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 152-159 (2009).</li>
<li>Na, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+patient-derived+xenografts+from+patients+with+gastrointestinal+stromal+tumors%3A+analysis+of+clinicopathological+characteristics+related+to+engraftment+success%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7996(2020).</li>
<li>Balachandran, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imatinib+potentiates+antitumor+T+cell+responses+in+gastrointestinal+stromal+tumor+through+the+inhibition+of+Ido%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imatinib potentiates antitumor T cell responses in gastrointestinal stromal tumor through the inhibition of Ido.</a> Nature Medicine. 17 (9), 1094-1100 (2011).</li>
<li>Vitiello, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+immune+profiles+distinguish+the+mutational+subtypes+of+gastrointestinal+stromal+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Differential immune profiles distinguish the mutational subtypes of gastrointestinal stromal tumor.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (5), 1863-1877 (2019).</li>
<li>Sommer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+stromal+tumors+in+a+mouse+model+by+targeted+mutation+of+the+Kit+receptor+tyrosine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6706-6711 (2003).</li>
<li>Cavnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIT+oncogene+inhibition+drives+intratumoral+macrophage+M2+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">KIT oncogene inhibition drives intratumoral macrophage M2 polarization.</a> Journal of Experimental Medicine. 210 (13), 2873-2886 (2013).</li>
<li>Medina, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+kinase+inhibition+limits+Batf3-dependent+dendritic+cell+development+and+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oncogenic kinase inhibition limits Batf3-dependent dendritic cell development and antitumor immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1359-1376 (2019).</li>
<li>Zhang, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+CD8%28%2B%29+T+cells+mediate+the+antitumor+efficacy+of+combined+CD40+ligation+and+imatinib+therapy+in+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Macrophages and CD8(+) T cells mediate the antitumor efficacy of combined CD40 ligation and imatinib therapy in gastrointestinal stromal tumors.</a> Cancer Immunology Research. 6 (4), 434-447 (2018).</li>
<li>General Protocol for Western Blotting. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Buttetin_6376.pdf</a> (2022).</li>
<li>Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSadeghipour%2C+A+%22Biobanking%3A+Methods+and+Protocols%22">Biobanking: Methods and Protocols</a>. , Springer. New York. 253-268 (2019).</li>
<li>Sy, J., Ang, L. -C. Microtomy: Cutting formalin-fixed, paraffin-embedded sections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSy%2C+J+%22Biobanking%3A+Methods+and+Protocols%22">Biobanking: Methods and Protocols</a>. , Springer. New York. 269-278 (2019).</li>
<li>Seifert, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1%2FPD-L1+blockade+enhances+T-cell+activity+and+antitumor+efficacy+of+imatinib+in+gastrointestinal+stromal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">PD-1/PD-L1 blockade enhances T-cell activity and antitumor efficacy of imatinib in gastrointestinal stromal tumors.</a> Clinical Cancer Research. 23 (2), 454-465 (2017).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+KIT+modulates+Type+I+IFN-mediated+antitumor+immunity+in+GIST%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Oncogenic KIT modulates Type I IFN-mediated antitumor immunity in GIST.</a> Cancer Immunology Research. 9 (5), 542-553 (2021).</li>
<li>Rossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Kit+signaling+and+therapeutic+intervention+in+a+mouse+model+of+gastrointestinal+stromal+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Kit signaling and therapeutic intervention in a mouse model of gastrointestinal stromal tumor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (34), 12843-12848 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Het KitV558Δ/+ muismodel is een krachtig onderzoeksinstrument in de moleculaire en immunologische analyse van GIST. Hoewel de fokstrategie een enkele kruising vereist, vereist het gebruik van KitV558Δ / + muiscohorten in experimenten die de tumorrespons analyseren, uitgebreide fokkerij. Muizen moeten leeftijds- en geslachtsgematcht zijn om vergelijkbare tumorgewichten te garanderen, en 10% van de muizen sterft vóór de leeftijd van 8 weken wanneer tumoren worden vastgesteld. Minder ...

GIST is het meest voorkomende sarcoom bij mensen met een incidentie van ongeveer 6.000 gevallen in de Verenigde Staten van Amerika1. GIST lijkt afkomstig te zijn van de gastro-intestinale pacemakercellen die de interstitiële cellen van Cajal worden genoemd en wordt meestal aangedreven door een enkele mutatie in de tyrosinekinase KIT of PDGFRA2. Chirurgie is de steunpilaar van de behandeling voor GIST en kan curatief zijn, maar patiënten met een gevorderde ziekte kunnen worden behandeld met de tyrosinekinaseremmer (TKI), imatinib. Sinds de introductie meer dan 20 jaar geleden heeft imatinib het behandelingsparadigma in GIST getransformeerd, waardoor de overleving bij gevorderde ziekte is verbeterd van 1 naar meer dan 5 jaar 3,4,5. Helaas is imatinib zelden curatief vanwege verworven KIT-mutaties, dus nieuwe behandelingen zijn nodig voor deze tumor.
Muismodellen zijn een belangrijk onderzoeksinstrument bij het onderzoek naar nieuwe therapieën bij kanker. Meerdere subcutane xenograft- en patiënt-afgeleide xenograftmodellen zijn ontwikkeld en onderzocht in GIST 6,7. Immunodeficiënte muizen vertegenwoordigen echter niet volledig menselijke GIST, omdat GISTs differentiële immuunprofielen hebben, afhankelijk van hun oncogene mutatie, en het veranderen van de gastro-intestinale tumormicro-omgeving verbetert de effecten van TKI-therapie 8,9. De KitV558Δ/+ muis heeft een heterozygote kiembaandeletie in Kit exon 11, die codeert voor het juxtamembrane domein, de meest gemuteerde plaats in menselijke GIST10. KitV558Δ/+ muizen ontwikkelen een enkele cecale GIST met 100% penetrantie, en tumoren hebben vergelijkbare histologie, moleculaire signalering, immuuninfiltratie en respons op therapie als menselijke GIST 8,11,12,13. Hier beschrijven we het fokken, behandelen en isoleren en verwerken van monsters in KitV558Δ / + muizen voor gebruik in moleculair en immunologisch onderzoek in GIST.

<table><tbody><tr><td>100 micron filter</td><td>EMSCO</td><td>1194-2360</td><td></td></tr><tr><td>1x RBC lysis buffer</td><td>Life Technologies</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>3mL syringe</td><td>Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences</td><td>14823435</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 &micro;l</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>40 micron filter</td><td>EMSCO</td><td>1194-2340</td><td></td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6546</td><td></td></tr><tr><td>70 micron filter</td><td>EMSCO</td><td>1194-2350</td><td></td></tr><tr><td>AKT antibody (C67E7)</td><td>Cell Signaling</td><td>4691</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Complete mini edta free protease inhibitor</td><td>Thomas Scientific</td><td>C852A34</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automated Cell Counter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable Scalpels</td><td>Thermo Fisher Scientific/Exel International</td><td>14-840-00</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Thomas Scientific</td><td>C756V81</td><td></td></tr><tr><td>Dog1 antibody</td><td>abcam</td><td>ab64085</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>ERK antibody (p44/42)</td><td>Cell Signaling</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thomas Scientific</td><td>C788U23</td><td></td></tr><tr><td>FIJI software</td><td>FIJI</td><td></td><td>https://imagej.net/software/fiji</td></tr><tr><td>Fisherbrand 850 Homogenizer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-340-169</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>University of Pennsylvania Cell Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imatinib mesylate</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1026</td><td></td></tr><tr><td>KIT antibody (D13A2)</td><td>Cell Signaling</td><td>3074</td><td></td></tr><tr><td>KitV558&Delta;/+ Genotyping</td><td>Transnetyx</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (1.5mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic</td><td>Vector Laboratories</td><td>BMK-2202</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 &micro;m</td><td>Rio-Rad</td><td>1620145</td><td></td></tr><tr><td>Nonfat Dry Milk</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9121673</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 Substitute</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>p-AKT antibody (S473)</td><td>Cell Signaling</td><td>4060</td><td></td></tr><tr><td>p-ERK antibody (p44/42)</td><td>Cell Signaling</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>p-KIT antibody (Y719)</td><td>Cell Signaling</td><td>3391</td><td></td></tr><tr><td>PMSF Protease Inhibitor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Proeinase K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP170050</td><td></td></tr><tr><td>Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes</td><td>Falcon/Thermo Fisher Scientific</td><td>14-959-2A</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>University of Pennsylvania Cell Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride (NaF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34076</td><td></td></tr><tr><td>TBS buffer (10x)</td><td>University of Pennsylvania Cell Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture dish (100mm2)</td><td>Thermo Fisher Scientific/Falcon</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>TrisHCL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1757500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Rio-Rad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;vivaCT 80 platform</td><td>Scanco medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

moleculaire en immunologische technieken in een genetisch gemanipuleerd muismodel van gastro-intestinale stromale tumor

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

Gastro-intestinale stromale tumor (GIST) is het meest voorkomende menselijke sarcoom en wordt meestal aangedreven door een enkele mutatie in de KIT-receptor. Voor alle tumortypen zijn talloze muismodellen ontwikkeld om de volgende generatie kankertherapieën te onderzoeken. In GIST gebruiken de meeste in vivo studies echter xenograft muismodellen die inherente beperkingen hebben. Hier beschrijven we een immunocompetent, genetisch gemanipuleerd muismodel van gastro-intestinale stromale tumor met een KitV558Δ / + -mutatie. In dit model wordt mutant KIT, het oncogen dat verantwoordelijk is voor de meeste GISTs, aangedreven door zijn endogene promotor die leidt tot een GIST die het histologische uiterlijk en immuuninfiltraat nabootst dat wordt gezien in menselijke GISTs. Bovendien is dit model met succes gebruikt om zowel gerichte moleculaire als immuuntherapieën te onderzoeken. Hier beschrijven we het fokken en onderhouden van een KitV558Δ/+ muizenkolonie. Daarnaast beschrijft dit artikel de behandeling en verkrijging van GIST, drainerende mesenteriale lymfeklier en aangrenzende blindedarm in KitV558Δ / + -muizen, evenals monstervoorbereiding voor moleculaire en immunologische analyses.

Het KitV558Δ/+ muismodel maakt het mogelijk om therapieën te onderzoeken in een immunocompetent muismodel. KitV558Δ/+ muizen hebben een gemiddelde levensduur van 8 maanden als gevolg van progressieve darmobstructie (figuur 4). Tumoren van KitV558Δ/+ muizen drukken canonieke markers van GIST uit, waaronder de tyrosinekinase KIT en het transmembraankanaal DOG1 (fi...

Het doel van dit manuscript is om het KitV558Δ/+ muismodel en technieken voor succesvolle dissectie en verwerking van muismonsters te beschrijven.

Moleculaire en immunologische technieken in een genetisch gemanipuleerd muismodel van gastro-intestinale stromale tumor

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Ons protocol beschrijft de veredeling, het onderhoud, de dissectie en de monsterverwerking van het enige immunocompetente muismodel, GIST, dat momenteel in gebruik is. We hopen dat toekomstige onderzoekers dit muismodel kunnen gebruiken om translationeel onderzoek in GIST te bevorderen. Traditionele therapieën in GIST omvatten gerichte moleculaire therapie met tyrosinekinaseremmers.Dit model stelt onderzoekers in staat om immunotherapieën in GIST te testen. Om te beginnen, steriliseer alle instrumenten, draag handschoenen tijdens de procedure en onderhoud een steriel veld. Bereid het gebied van incisie voor met 70% ethanol.Maak met een schaar een verticale incisie van twee centimeter in de middellijn en ga de buikholte in. Lyseer scherp eventuele intra-abdominale verklevingen. Om de drainerende mesenteriale lymfeklier te verwijderen, identificeert u de blindedarm en tilt u het mesenterium superieur op.Ongeveer halverwege de basis van het colon mesenterium, identificeer de mesenteriale lymfeklier en ontleed deze scherp. Verdeel indien nodig lymfeklierweefsel in derden voor eiwitisolatie, histologie en eencellige suspensie. Plaats lymfeklierweefsel in 20 milliliter RPMI-medium voor eencellige suspensies en houd op ijs.De blindedarm wordt meestal vervangen door een GIST bij de Kit558 muizen. Voor isolatie van de GIST en blindedarm, deel de ileocolic junction zorgvuldig van de basis van de tumor. Deel vervolgens de blindedarm opnieuw, twee centimeter distaal naar de basis van de tumor.Bij 50 tot 60% van de Kit558-muizen bevat het hoofd van de tumor een dop van cecal-weefsel, dat meestal sereuze vloeistof bevat, maar zelden pus kan bevatten. Ontleed het dopweefsel scherp weg van het tumorweefsel. Verdeel het tumorweefsel en de blindedarm in drieën voor eiwitisolatie, histologie en eencellige suspensie.Plaats voor eencellige suspensies tumorweefsel of blindedarm in HBSS met 2% FCS, genoeg om het monster te bedekken en op ijs te houden. Giet RPMI-media met het lymfekliermonster over een filter van 100 micrometer. Verplaats het filter naar een nieuwe conische 50 milliliter en pureer de lymfeklier met het zachte uiteinde van een plastic spuit van drie milliliter.Wasfilter met 20 milliliter RPMI-media. Centrifugeer de monsters en zuig het supernatant aan. Resuspendeer de pellet in 20 milliliter kraalbuffer en giet over een filter van 40 micrometer.Verzamel het celfiltraat. Tel cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de monsters en gooi het supernatant weg.Resuspendeer vervolgens in kraalbuffer voor flowcytometrie. Bereid collagenasebuffer voor zoals beschreven in het tekstmanuscript. Doe GIST in een steriele schaal en voeg 2,5 milliliter collagenasebuffer toe.Gebruik een steriel scalpel en een schaar om de tumor te hakken totdat deze in fijne fragmenten zit. Gebruik een pipet met grote boring om de tumor en collagenase in een buis van 50 milliliter te zuigen. Incubeer het bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten met 100 rotaties per minuut en doof de reactie vervolgens met twee milliliter FBS.Giet collagenase met GIST-monster over een filter van 100 micrometer en pureer de tumor met het zachte uiteinde van een plastic spuit van drie milliliter en verzamel in een buis van 50 milliliter. Wasfilter met 20 milliliter HBSS. Centrifugeer het filtraat op 450 RCF gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant vervolgens weg.Resuspendeer de pellet in 20 milliliter kraalbuffer en giet over een filter van 40 micrometer Verzamel het filtraat en tel cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer en aspirateer het supernatant en resuspenseer vervolgens in kraalbuffer voor flowcytometrie. Splits met behulp van een schaar de blindedarm in de lengterichting om het binnenste slijmvlies bloot te leggen.Snijd het in secties van 0,5 centimeter en plaats het in een buis van 50 milliliter met vijf milliliter HBSS en 2% FBS. Schud krachtig gedurende 30 seconden en centrifugeer gedurende 20 seconden op 450 RCF. Gooi vervolgens het supernatant weg.Voeg vijf tot 20 milliliter HBSS toe met twee millimolaire EDTA. Incubeer het bij 37 graden Celsius bij 100 rotaties per minuut gedurende 15 minuten. Centrifugeer en gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet vervolgens in vijf tot 20 milliliter HBSS.Schud het mengsel krachtig gedurende 30 seconden, centrifugeer vervolgens op 450 RCF gedurende 20 seconden en gooi het supernatant weg. Herhaal dit proces nogmaals. Resuspendeer de pellet in vijf milliliter collagenasebuffer en incubeer deze vervolgens bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten met 100 rotaties per minuut.Schud krachtig om de 10 minuten en doof de reactie met twee milliliter FBS. Giet collagenase met blindedarmmonster over een filter van 100 micrometer en pureer met het zachte uiteinde van een plastic spuit van drie milliliter. Was het filter met 20 milliliter HBSS en vang het filtraat op.Centrifugeer en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de pellet in 20 milliliter kraalbuffer en giet over een filter van 40 micrometer. Verzamel filtraat en tel cellen met behulp van een hemocytometer.Herhaal het centrifugatieproces nogmaals en resuspenseer de pellet in kraalbuffer voor flowcytometrie. De Kit558-muizen hadden een gemiddelde levensduur van acht maanden als gevolg van progressieve darmobstructie. Tumoren van de Kit558-muizen brachten canonieke markers van GIST tot expressie, waaronder de tyrosinekinase KIT, het transmembraankanaal Dog1 en de transcriptiefactor ETV1.Tumoren werden bestudeerd voor veranderingen in de KIT-signaleringsroute zoals de downstream markers ERK en AKT of immuunmicro-omgeving, die de menselijke GIST nauw nabootsten. MRI of CT werd gebruikt om het tumorvolume te volgen als een nauwkeurige meting van de tumorrespons. Het ontleden van de tumor weg van de ileocolic junction en weg van de cecal cap is belangrijk om het werkelijke tumorgewicht en immuun- en moleculaire analyse vast te leggen.Binnen GIST heeft dit model het onderzoek van de micro-omgeving van de tumor mogelijk gemaakt, evenals immunotherapieën.

molecular-immunologic-techniques-genetically-engineered-mouse-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Het genereren en karakteriseren van tumorspecifieke T-cellen met gehumaniseerde muizen wordt hier beschreven. Human thymusweefsel en genetisch gemodificeerde humane hematopoietische stamcellen worden getransplanteerd in immunodeficiënte muizen. Dit resulteert in de bereiding van een op menselijke immuunsysteem waardoor in vivo onderzoek van anti-tumor immuunrespons.

Met behulp van de BLT Gehumaniseerd Muis als een Stem Cell gebaseerde Gene Therapy tumormodel

Hier beschrijven we een efficiënt en veelzijdig protocol om nieuwe glioblastoma (GBM) te induceren, monitoren en analyseren met behulp van transposon DNA dat in de ventrikels van neonatale muizen wordt geïnjecteerd. Cellen van de subventriculaire zone, die het plasmide opnemen, transformeren, prolifereren en genereren tumoren met histo-pathologische kenmerken van menselijk GBM.

Transposon Mediated Integratie van plasmide DNA in de subventriculaire zone van pasgeboren muizen om Novel Modellen van glioblastoma Genereer

Hier beschrijven we het model en de aanpak om functies van pulmonaire alveolaire macrofagen in kankermetastase te bestuderen. Om de rol van deze cellen in metastase te demonstreren, werd het syngene (4T1) model van borstkanker gebruikt in combinatie met de depletie van alveolaire macrofagen met clodronat liposomen.

Het bestuderen van de rol van alveolaire macrofagen in de uitzaaiing van borstkanker

Dit protocol beschrijft de generatie van muizen orthotope blaastumoren bij vrouwelijke C57BL / 6J muizen en de monitoring van tumorgroei.

Een muizen orthotope Blaas Tumor Model en Tumor Detection System

Een protocol voor de oprichting van een genetisch gemanipuleerde muismodel van colorectale kanker door middel van segmentale adeno-cre infectie en zijn bewaking via hoge resolutie colonoscopie wordt gepresenteerd.

Een genetisch ontwikkeld muis model van sporadische colorectale kanker

Laser microdissectie (LMD) is een gevoelige en zeer reproduceerbare techniek die kan worden gebruikt om paden die glioom heterogeniteit en invasie te bemiddelen blootleggen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol om discrete gebieden te isoleren van glioomweefsel met behulp van laser LMD, gevolgd door transcriptomische analyse.

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Dit artikel beschrijft een workflow van technieken die worden gebruikt voor het testen van nieuwe kandidaat-mediatoren van melanoommetastase en hun werkingsmechanisme (s).

Een robuust ontdekkingsplatform voor de identificatie van nieuwe mediatoren van melanoommetastase

Het gebruik van een immunocompetent, autochtoon tumormodel aangedreven door gemeenschappelijke patiëntmutaties voor preklinische tests is van cruciaal belang voor immunotherapeutische tests. Dit protocol beschrijft een methode om muismodellen voor hersentumoren te genereren met behulp van op elektroporatie gebaseerde afgifte van plasmide-DNA die veelvoorkomende patiëntmutaties vertegenwoordigen, waardoor een nauwkeurig, reproduceerbaar en consistent muismodel wordt verkregen.

Modellering van hersentumoren in vivo met behulp van op elektroporatie gebaseerde afgifte van plasmide-DNA dat de handtekeningen van patiëntmutaties vertegenwoordigt

We hebben een methodologie ontwikkeld om te beoordelen of neoplasmata van het zenuwstelsel in genetisch gemanipuleerde muizen de pathologie van hun menselijke tegenhangers nauwkeurig samenvatten. Hier passen we deze histologische technieken, gedefinieerde pathologische criteria en kweekmethodologieën toe op neurofibromen en kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren die ontstaan in het P 0-GGFβ3 muismodel.

Identificeren, diagnosticeren en beoordelen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren in genetisch gemanipuleerde muismodellen

Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Leer dissectie- en verwerkingsmethoden voor het Kit V558Δ/+ muismodel van gastro-intestinale stromale tumor. Deze technieken ondersteunen translationeel onderzoek naar immunotherapieën voor GIST.

Moleculaire en immunologische technieken in een genetisch gemanipuleerd muismodel van gastro-intestinale stromale tumor

Meer video's verkennen