Moleculaire en immunologische technieken in een genetisch gemanipuleerd muismodel van gastro-intestinale stromale tumor
May 2nd, 2022
Het doel van dit manuscript is om het KitV558Δ/+ muismodel en technieken voor succesvolle dissectie en verwerking van muismonsters te beschrijven.
Ons protocol beschrijft de veredeling, het onderhoud, de dissectie en de monsterverwerking van het enige immunocompetente muismodel, GIST, dat momenteel in gebruik is. We hopen dat toekomstige onderzoekers dit muismodel kunnen gebruiken om translationeel onderzoek in GIST te bevorderen. Traditionele therapieën in GIST omvatten gerichte moleculaire therapie met tyrosinekinaseremmers.
Dit model stelt onderzoekers in staat om immunotherapieën in GIST te testen. Om te beginnen, steriliseer alle instrumenten, draag handschoenen tijdens de procedure en onderhoud een steriel veld. Bereid het gebied van incisie voor met 70% ethanol.
Maak met een schaar een verticale incisie van twee centimeter in de middellijn en ga de buikholte in. Lyseer scherp eventuele intra-abdominale verklevingen. Om de drainerende mesenteriale lymfeklier te verwijderen, identificeert u de blindedarm en tilt u het mesenterium superieur op.
Ongeveer halverwege de basis van het colon mesenterium, identificeer de mesenteriale lymfeklier en ontleed deze scherp. Verdeel indien nodig lymfeklierweefsel in derden voor eiwitisolatie, histologie en eencellige suspensie. Plaats lymfeklierweefsel in 20 milliliter RPMI-medium voor eencellige suspensies en houd op ijs.
De blindedarm wordt meestal vervangen door een GIST bij de Kit558 muizen. Voor isolatie van de GIST en blindedarm, deel de ileocolic junction zorgvuldig van de basis van de tumor. Deel vervolgens de blindedarm opnieuw, twee centimeter distaal naar de basis van de tumor.
Bij 50 tot 60% van de Kit558-muizen bevat het hoofd van de tumor een dop van cecal-weefsel, dat meestal sereuze vloeistof bevat, maar zelden pus kan bevatten. Ontleed het dopweefsel scherp weg van het tumorweefsel. Verdeel het tumorweefsel en de blindedarm in drieën voor eiwitisolatie, histologie en eencellige suspensie.
Plaats voor eencellige suspensies tumorweefsel of blindedarm in HBSS met 2% FCS, genoeg om het monster te bedekken en op ijs te houden. Giet RPMI-media met het lymfekliermonster over een filter van 100 micrometer. Verplaats het filter naar een nieuwe conische 50 milliliter en pureer de lymfeklier met het zachte uiteinde van een plastic spuit van drie milliliter.
Wasfilter met 20 milliliter RPMI-media. Centrifugeer de monsters en zuig het supernatant aan. Resuspendeer de pellet in 20 milliliter kraalbuffer en giet over een filter van 40 micrometer.
Verzamel het celfiltraat. Tel cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de monsters en gooi het supernatant weg.
Resuspendeer vervolgens in kraalbuffer voor flowcytometrie. Bereid collagenasebuffer voor zoals beschreven in het tekstmanuscript. Doe GIST in een steriele schaal en voeg 2,5 milliliter collagenasebuffer toe.
Gebruik een steriel scalpel en een schaar om de tumor te hakken totdat deze in fijne fragmenten zit. Gebruik een pipet met grote boring om de tumor en collagenase in een buis van 50 milliliter te zuigen. Incubeer het bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten met 100 rotaties per minuut en doof de reactie vervolgens met twee milliliter FBS.
Giet collagenase met GIST-monster over een filter van 100 micrometer en pureer de tumor met het zachte uiteinde van een plastic spuit van drie milliliter en verzamel in een buis van 50 milliliter. Wasfilter met 20 milliliter HBSS. Centrifugeer het filtraat op 450 RCF gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant vervolgens weg.
Resuspendeer de pellet in 20 milliliter kraalbuffer en giet over een filter van 40 micrometer Verzamel het filtraat en tel cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer en aspirateer het supernatant en resuspenseer vervolgens in kraalbuffer voor flowcytometrie. Splits met behulp van een schaar de blindedarm in de lengterichting om het binnenste slijmvlies bloot te leggen.
Snijd het in secties van 0,5 centimeter en plaats het in een buis van 50 milliliter met vijf milliliter HBSS en 2% FBS. Schud krachtig gedurende 30 seconden en centrifugeer gedurende 20 seconden op 450 RCF. Gooi vervolgens het supernatant weg.
Voeg vijf tot 20 milliliter HBSS toe met twee millimolaire EDTA. Incubeer het bij 37 graden Celsius bij 100 rotaties per minuut gedurende 15 minuten. Centrifugeer en gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet vervolgens in vijf tot 20 milliliter HBSS.
Schud het mengsel krachtig gedurende 30 seconden, centrifugeer vervolgens op 450 RCF gedurende 20 seconden en gooi het supernatant weg. Herhaal dit proces nogmaals. Resuspendeer de pellet in vijf milliliter collagenasebuffer en incubeer deze vervolgens bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten met 100 rotaties per minuut.
Schud krachtig om de 10 minuten en doof de reactie met twee milliliter FBS. Giet collagenase met blindedarmmonster over een filter van 100 micrometer en pureer met het zachte uiteinde van een plastic spuit van drie milliliter. Was het filter met 20 milliliter HBSS en vang het filtraat op.
Centrifugeer en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de pellet in 20 milliliter kraalbuffer en giet over een filter van 40 micrometer. Verzamel filtraat en tel cellen met behulp van een hemocytometer.
Herhaal het centrifugatieproces nogmaals en resuspenseer de pellet in kraalbuffer voor flowcytometrie. De Kit558-muizen hadden een gemiddelde levensduur van acht maanden als gevolg van progressieve darmobstructie. Tumoren van de Kit558-muizen brachten canonieke markers van GIST tot expressie, waaronder de tyrosinekinase KIT, het transmembraankanaal Dog1 en de transcriptiefactor ETV1.
Tumoren werden bestudeerd voor veranderingen in de KIT-signaleringsroute zoals de downstream markers ERK en AKT of immuunmicro-omgeving, die de menselijke GIST nauw nabootsten. MRI of CT werd gebruikt om het tumorvolume te volgen als een nauwkeurige meting van de tumorrespons. Het ontleden van de tumor weg van de ileocolic junction en weg van de cecal cap is belangrijk om het werkelijke tumorgewicht en immuun- en moleculaire analyse vast te leggen.
Binnen GIST heeft dit model het onderzoek van de micro-omgeving van de tumor mogelijk gemaakt, evenals immunotherapieën.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit manuscript beschrijft het Kit V558Δ/+ muismodel en schetst technieken voor het succesvol dissekeren en verwerken van muisspecimens. Het protocol heeft tot doel translationeel onderzoek naar gastro-intestinale stromale tumoren (GIST) te vergemakkelijken met behulp van dit immunocompetente model.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biologie
- Translationeel Onderzoek
Achtergrond
- Het Kit V558Δ/+ muismodel is momenteel het enige immunocompetente model voor GIST.
- Traditionele therapieën voor GIST omvatten gerichte moleculaire therapie.
- Dit model maakt het testen van immunotherapieën mogelijk.
- Juiste dissectie en specimenverwerking zijn cruciaal voor onderzoeksnauwkeurigheid.
Doel van het onderzoek
- Om de kweek en onderhoud van het Kit V558Δ/+ muismodel te beschrijven.
- Om een gedetailleerd protocol voor dissectie en specimenverwerking te bieden.
- Om de begrip van GIST te verbeteren en onderzoeksmethodologieën te optimaliseren.
Gebruikte methoden
- Kweek en onderhoud van het Kit V558Δ/+ muismodel.
- Sterilisering van instrumenten en handhaving van een steriel veld.
- Voorbereiding van incisiegebieden met 70% ethanol.
- Gedetailleerde dissectie- en specimenverwerkingstechnieken.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol zorgt voor succesvolle dissectie en verwerking van specimens.
- Maakt het gebruik van het Kit V558Δ/+ model in toekomstig onderzoek mogelijk.
- Biedt een basis voor het testen van immunotherapieën in GIST.
Conclusies
- Het Kit V558Δ/+ muismodel is een waardevol hulpmiddel voor GIST-onderzoek.
- Juiste technieken bij dissectie en verwerking zijn essentieel voor betrouwbare resultaten.
- Dit onderzoek heeft tot doel toekomstig translationeel onderzoek in GIST te ondersteunen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
The KitV558Δ/+ genetically engineered mouse model provides an immunocompetent, disease-relevant system for translational research in gastrointestinal stromal tumor (GIST). This model enables rigorous evaluation of both targeted molecular and immune therapies, addressing the limitations of xenograft models and supporting predictive confidence in preclinical oncology pipelines. Its alignment with human GIST histology and immune microenvironment enhances mechanistic de-risking and informs portfolio advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of KIT-driven oncogenic pathways in a physiologically relevant context.
- Supports functional target validation by recapitulating human GIST immune infiltrate and histology.
- Facilitates mechanistic de-risking for both molecular and immunologic therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides validated tumor and lymphoid tissues for downstream molecular and immunologic assays.
- Enables reproducible preparation of single-cell suspensions for flow cytometry and quantitative analysis.
- Supports assay standardization and scalability for compound and immunotherapy screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical findings with human disease biology, enhancing translational biomarker relevance.
- Enables longitudinal imaging and quantitative tumor response assessment via MRI or CT.
- Supports risk-adjusted advancement of immunotherapies and targeted agents in GIST.
Pipeline & Workflow Integration
This model bridges early discovery, lead identification, and preclinical validation for GIST, supporting robust hypothesis testing and translational continuity.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification and immune microenvironment analysis in KIT-mutant GIST.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for molecular and immunologic assays.
- Analytics: Enables measurement of tumor volume, immune cell populations, and pathway activation markers.
- Translational Research: Provides a platform for biomarker alignment and preclinical efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, immunocompetent model for ongoing GIST research and therapeutic evaluation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in GIST research.
- Operational Value: Standardizes specimen processing and assay workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in oncology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of novel GIST therapies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetically engineered mouse model breeding and maintenance.
- Demands access to sterile surgical instrumentation and advanced imaging modalities.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and analytical protocols.
- Adaptation may be needed for integration with diverse molecular and immunologic assay platforms.
- Model lifespan and tumor progression rates must be considered in experimental design.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
KitV558Δ/+ Mouse Organ Harvest
2:26
Single-Cell Suspension of Mesenteric Lymph Node
3:09
Single-Cell Suspension of GIST
4:22
Single-Cell Suspension of Cecum
6:06
Results: Investigation of Therapeutics in an Immunocompetent Mouse Model
6:49
Conclusion
