Moleculaire en immunologische technieken in een genetisch gemanipuleerd muismodel van gastro-intestinale stromale tumor

Ons protocol beschrijft de veredeling, het onderhoud, de dissectie en de monsterverwerking van het enige immunocompetente muismodel, GIST, dat momenteel in gebruik is. We hopen dat toekomstige onderzoekers dit muismodel kunnen gebruiken om translationeel onderzoek in GIST te bevorderen. Traditionele therapieën in GIST omvatten gerichte moleculaire therapie met tyrosinekinaseremmers.

Dit model stelt onderzoekers in staat om immunotherapieën in GIST te testen. Om te beginnen, steriliseer alle instrumenten, draag handschoenen tijdens de procedure en onderhoud een steriel veld. Bereid het gebied van incisie voor met 70% ethanol.

Maak met een schaar een verticale incisie van twee centimeter in de middellijn en ga de buikholte in. Lyseer scherp eventuele intra-abdominale verklevingen. Om de drainerende mesenteriale lymfeklier te verwijderen, identificeert u de blindedarm en tilt u het mesenterium superieur op.

Ongeveer halverwege de basis van het colon mesenterium, identificeer de mesenteriale lymfeklier en ontleed deze scherp. Verdeel indien nodig lymfeklierweefsel in derden voor eiwitisolatie, histologie en eencellige suspensie. Plaats lymfeklierweefsel in 20 milliliter RPMI-medium voor eencellige suspensies en houd op ijs.

De blindedarm wordt meestal vervangen door een GIST bij de Kit558 muizen. Voor isolatie van de GIST en blindedarm, deel de ileocolic junction zorgvuldig van de basis van de tumor. Deel vervolgens de blindedarm opnieuw, twee centimeter distaal naar de basis van de tumor.

Bij 50 tot 60% van de Kit558-muizen bevat het hoofd van de tumor een dop van cecal-weefsel, dat meestal sereuze vloeistof bevat, maar zelden pus kan bevatten. Ontleed het dopweefsel scherp weg van het tumorweefsel. Verdeel het tumorweefsel en de blindedarm in drieën voor eiwitisolatie, histologie en eencellige suspensie.

Plaats voor eencellige suspensies tumorweefsel of blindedarm in HBSS met 2% FCS, genoeg om het monster te bedekken en op ijs te houden. Giet RPMI-media met het lymfekliermonster over een filter van 100 micrometer. Verplaats het filter naar een nieuwe conische 50 milliliter en pureer de lymfeklier met het zachte uiteinde van een plastic spuit van drie milliliter.

Wasfilter met 20 milliliter RPMI-media. Centrifugeer de monsters en zuig het supernatant aan. Resuspendeer de pellet in 20 milliliter kraalbuffer en giet over een filter van 40 micrometer.

Verzamel het celfiltraat. Tel cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de monsters en gooi het supernatant weg.

Resuspendeer vervolgens in kraalbuffer voor flowcytometrie. Bereid collagenasebuffer voor zoals beschreven in het tekstmanuscript. Doe GIST in een steriele schaal en voeg 2,5 milliliter collagenasebuffer toe.

Gebruik een steriel scalpel en een schaar om de tumor te hakken totdat deze in fijne fragmenten zit. Gebruik een pipet met grote boring om de tumor en collagenase in een buis van 50 milliliter te zuigen. Incubeer het bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten met 100 rotaties per minuut en doof de reactie vervolgens met twee milliliter FBS.

Giet collagenase met GIST-monster over een filter van 100 micrometer en pureer de tumor met het zachte uiteinde van een plastic spuit van drie milliliter en verzamel in een buis van 50 milliliter. Wasfilter met 20 milliliter HBSS. Centrifugeer het filtraat op 450 RCF gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en gooi het supernatant vervolgens weg.

Resuspendeer de pellet in 20 milliliter kraalbuffer en giet over een filter van 40 micrometer Verzamel het filtraat en tel cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer en aspirateer het supernatant en resuspenseer vervolgens in kraalbuffer voor flowcytometrie. Splits met behulp van een schaar de blindedarm in de lengterichting om het binnenste slijmvlies bloot te leggen.

Snijd het in secties van 0,5 centimeter en plaats het in een buis van 50 milliliter met vijf milliliter HBSS en 2% FBS. Schud krachtig gedurende 30 seconden en centrifugeer gedurende 20 seconden op 450 RCF. Gooi vervolgens het supernatant weg.

Voeg vijf tot 20 milliliter HBSS toe met twee millimolaire EDTA. Incubeer het bij 37 graden Celsius bij 100 rotaties per minuut gedurende 15 minuten. Centrifugeer en gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet vervolgens in vijf tot 20 milliliter HBSS.

Schud het mengsel krachtig gedurende 30 seconden, centrifugeer vervolgens op 450 RCF gedurende 20 seconden en gooi het supernatant weg. Herhaal dit proces nogmaals. Resuspendeer de pellet in vijf milliliter collagenasebuffer en incubeer deze vervolgens bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten met 100 rotaties per minuut.

Schud krachtig om de 10 minuten en doof de reactie met twee milliliter FBS. Giet collagenase met blindedarmmonster over een filter van 100 micrometer en pureer met het zachte uiteinde van een plastic spuit van drie milliliter. Was het filter met 20 milliliter HBSS en vang het filtraat op.

Centrifugeer en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de pellet in 20 milliliter kraalbuffer en giet over een filter van 40 micrometer. Verzamel filtraat en tel cellen met behulp van een hemocytometer.

Herhaal het centrifugatieproces nogmaals en resuspenseer de pellet in kraalbuffer voor flowcytometrie. De Kit558-muizen hadden een gemiddelde levensduur van acht maanden als gevolg van progressieve darmobstructie. Tumoren van de Kit558-muizen brachten canonieke markers van GIST tot expressie, waaronder de tyrosinekinase KIT, het transmembraankanaal Dog1 en de transcriptiefactor ETV1.

Tumoren werden bestudeerd voor veranderingen in de KIT-signaleringsroute zoals de downstream markers ERK en AKT of immuunmicro-omgeving, die de menselijke GIST nauw nabootsten. MRI of CT werd gebruikt om het tumorvolume te volgen als een nauwkeurige meting van de tumorrespons. Het ontleden van de tumor weg van de ileocolic junction en weg van de cecal cap is belangrijk om het werkelijke tumorgewicht en immuun- en moleculaire analyse vast te leggen.

Binnen GIST heeft dit model het onderzoek van de micro-omgeving van de tumor mogelijk gemaakt, evenals immunotherapieën.