Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization door Nano-Flow Cytometry

Diepgaande karakterisering van EV's kan een uitdaging zijn, waarvoor meerdere instrumenten nodig zijn om individuele parameters te beschrijven. Het meten van deze belangrijke criteria in een enkele techniek zoals Nano-Flow Cytometry beschrijft meerdere EV's subpopulaties tegelijkertijd. Dus elke EV wordt individueel gemeten en identificeert deeltjes groter dan 14 nanometer in diameter labelvrij voordat hun fluorescentie wordt bepaald.

Dit zorgt voor een robuuste dataset door valse positieven te verwijderen. Nano-Flow Cytometrie kan worden toegepast op EV's uit verschillende bronnen, waaronder die verrijkt met plasma, CSF en kweekmedium. Deze techniek wordt ook gebruikt voor de analyse van virussen, lipide nanodeeltjes en nanomaterialen.

Het is belangrijk om het etiketteringsprotocol te optimaliseren. Dit maximaliseert elke fluorescentie geassocieerd met een deeltje in vergelijking met eventuele resterende fluorescentie die in de buffer achterblijft. Schakel om te beginnen het instrument in, laad Nano-Flow Profession en selecteer Opstarten in het vervolgkeuzemenu Schedestroom, laad water in het laadperron en selecteer Boosting in het vervolgkeuzemenu Schedestroom.

Verdun de QC-kralen één tot 100 in gedestilleerd water in een buis van 0,6 microliter en plaats deze in het laadperron om het monster in het systeem te introduceren. Geef het monster vervolgens 45 seconden een boost zoals eerder gedemonstreerd om het vorige monster, water of reinigingsoplossing volledig te vervangen. Stel tijdens het boosten het laservermogen in op de vooraf ingestelde sjabloon voor QC-kralen op de FL QC-standaard van 250 nanometer.

Later, om de systeemdruk te verlagen, selecteert u de bemonsteringsdruk in hetzelfde vervolgkeuzemenu en stelt u de automatische bemonsteringsdruk in op één kilo pascal om een constante druk te behouden. Start vervolgens de analyse van één minuut door Time To Record te selecteren in de acquisitiebesturingselementen. Gegevens worden uitgezet op de dot plot met een logschaal voor zijdelingse verstrooiingsintensiteit en een geselecteerde fluorescentie-intensiteit.

Voordat u het bestand opslaat, voegt u de bestandsnaam en voorbeeldverdunning in. Selecteer vervolgens lossen om de buis van het laadperron te verwijderen. Vervang de QC-kralen door 150 microliter reinigingsoplossing en reinig gedurende meer dan 30 seconden door Boosting te selecteren.

Gebruik een buis met 150 microliter water en verwijder overtollige reinigingsoplossing uit de capillaire punt door de punt in water te dopen. Verdun vervolgens de maat standaard kralen één tot 100 in water en laad 100 microliter in het laadperron. Stel nu het laservermogen in op de vooraf ingestelde sjabloon, S16 EXO 68 tot 155 nanometer.

Deze instelling geldt voor zowel de groottestandaard als monsters met EV's kleiner dan 200 nanometer. Selecteer bemonstering en ga verder met het opnemen van het monster gedurende één minuut. Voer de derde meting uit met een water- of PBS-monster om een blanco meetdevaluent te maken, waarbij valse positieven worden geïdentificeerd voor verwijdering door de software.

Verdun de niet-gelabelde EV-monsters in PBS tot een geschikt deeltjesconcentratiebereik van één keer 10 tot de achtste tot vijf keer 10 tot de achtste deeltjes per milliliter voor nFCM-analyse. En laad 10 tot 100 microliter van het verdunde monster in het laadperron. Als de deeltjesconcentratie onbekend is, begin dan met een verdunning van één tot 100 van het EV-monster.

De monsterconcentratie kan snel worden benaderd door de grootte van de laservlek op de CCD-camera tijdens het boosten, of door observatie van de gebeurtenis burst trace tijdens de bemonstering. Zodra het geladen voorbeeld gedurende 45 seconden is versterkt, neemt u één minuut op en slaat u het bestand op zoals eerder gedemonstreerd. Begin na het opnemen met het analyseren van deze gegevens, schakel over van het tabblad Acquisitie naar het tabblad Analyse en open de opgeslagen NFA-bestanden.

Gebruik voor een nauwkeurige monstermeting de twee standaardmetingen die voorafgaand aan de bemonsteringsmeting zijn uitgevoerd om waarden voor monstervergelijking en de blancowaarde in te stellen. Maak de groottestandaardcurve voor de conversie van zijverstrooiing naar diameter door het standaardformaatbestand te selecteren en het ingestelde drempelgereedschap te gebruiken. De drempel, zichtbaar in de gebeurtenis burst trace, geeft de minimale signaalintensiteit aan die nodig is om een gebeurtenis als significant te beschouwen.

Als de drempel is ingesteld, controleert u de dot plot-parameters, SS-H of SS-A op de X-as en FITC-A op de Y-as. Open het gereedschap Standard Curve Generation en selecteer S16 EXO 68 tot 155 nanometer als maatsjabloon. Klik op Find Peaks om de piekverstrooiingsintensiteiten aan de zijkant te identificeren als deeltjes met een diameter van 68, 91, 113 of 155 nanometer.

Controleer voordat u het venster sluit of de zijwaartse curve met een verstrooide diameter is gegenereerd met een R-waarde in de buurt van één. Stel de concentratienorm in. Selecteer het opgeslagen bestand, klik op telstandaard en voer de deeltjesconcentratie van de standaard in.

Stel de standaardinformatie in. Selecteer het EV-voorbeeldbestand en stel de drempel in. Selecteer het lege bestand en klik op leeg instellen om het aantal fout-positieven te identificeren dat uit het aantal monsters moet worden verwijderd.

Zodra de PDF Generation Tool is geopend, controleert u de grootte, concentratie en de verdunningen van het monster. Toon vervolgens de concentratie van het monster en de grootteverdeling van de deeltjes. Na het labelen van de EV-monsters zoals beschreven in het manuscript, neemt u één microliter van het gelabelde monster en verdunt u één tot 50 in PBS in een buis van 0,6 milliliter.

Laad het monster in het laadperron en oefen gedurende 45 seconden opvoerdruk uit. Zorg ook voor de juiste laserinstellingen en dat de juiste lenzen zijn geladen. Schakel nu over naar bemonsteringsdruk en selecteer de tijd die u wilt opnemen.

Na de overname van één minuut geeft u het gegevensbestand een naam en slaat u het op. Verwijder het monster, vervang het door een reinigingsoplossing en verhoog de reinigingsoplossing gedurende meer dan 30 seconden voordat het volgende gelabelde monster wordt geladen, zoals eerder aangetoond. Pas voor het genereren van PDF's dezelfde standaarden toe als eerder gedemonstreerd.

Alleen de blanco meting wordt anders ingesteld. Selecteer het voorbeeldbestand en stel de drempelwaarde in. Selecteer het gating-gereedschap en gebruik de linkerklik om een lijn te tekenen die de fluorescentiepositieve populatie scheidt.

Stel de namen en kleuren voor weergave in. Stel het lege bestand in en klik op leeg instellen om het aantal valse positieven te identificeren dat uit elke verschillende populatie moet worden verwijderd. Open de PDF Generation Tool en identificeer de grootteverdeling, concentratie en het percentage van de fluorescentiepositieve subpopulatie.

Wijzig op de dot plot de Y-as om fluorescentiemetingen van het groene of rode kanaal weer te geven. Stel de lege ruimte in en genereer de PDF zoals eerder gedemonstreerd. Stel op de dot plot de X-as in op FITC en de Y-as op APC.

Gebruik de kwadranttool om dubbele fluorescerende positieve populaties te identificeren. Stel namen en kleuren in om representatief te zijn, open vervolgens het PDF-bestand en selecteer de fluorescerende subpopulaties. C2C12 afgeleide EV's vertoonden ongeveer 50% CD9, 30% CD63-presentatie en 70% populatie presenteerde ten minste één van de drie EV-markers.

De grootteprofielen voor enkele tetraspanine-gelabelde EV-subpopulaties toonden een grotere mediane grootte van ongeveer 75 tot 85 nanometer en minder dan 65 nanometer EV's in vergelijking met de totale deeltjespopulatie. SW620-afgeleide EV's vertoonden ongeveer 40% CD9, 7% CD63-presentatie en 42% van de deeltjes met ten minste één van de drie markers. De van SW620 afgeleide, tetraspanine-gelabelde EV's vertoonden een meer normale verdeling en een grotere mediane diameter tussen 90 en 110 nanometer met vergelijkbare verdelingen tussen individuele tetraspaninepositieve subpopulaties.

Membraanetikettering toonde herhaaldelijk 80% positiviteit van C2C12 en SW620-afgeleide EV's. De zijdelingse verstrooiingsintensiteit correleerde met fitc-intensiteit op de dot plots van zowel C2C12 als SW620. De dubbele positieve percentages lijken sterk op de tetraspanine positieve percentages.

En CD63-etikettering lijkt de zwakste correlatie met membraanetikettering te vertonen. Het percentage positiviteitsmetingen was vergelijkbaar tussen de antilichaametikettering met en zonder aanvullende membraanetikettering. Gemiddelde fluorescentie-intensiteit voor de fluorescerende populaties van C2C12-afgeleide EV's suggereerde een lagere presentatie van CD63 en CD81 in vergelijking met CD9 EV's, terwijl SW620 aantoonde dat het gebruik van alle drie de antilichamen een groter fluorescentiesignaal oplevert dan elk individueel antilichaamlabel In dit protocol zijn gemeenschappelijke EV-markers fluorescerend gelabeld, maar veel van de antilichaamdoelen kunnen worden gekozen om de EV-oorsprong aan te tonen, de EV-functie, oftewel de ziektetoestand.