Een succesvolle sortering instellen voor extracellulaire isolatie van blaasjes

De belangrijkste focus van ons onderzoek is dus het bestuderen van mesenchymale stromale cellen, extracellulair blaasje voor weefselregeneratie. Een kwestie en een doel van ons onderzoek is om de celvrije benadering te vertalen naar klinische toepassing naast celtherapieën. Karakterisering is cruciaal en tegenwoordig is het erg moeilijk om een zuiver blaasje te hebben voor een diepe karakterisering omdat er geen protocollen zijn om een hoge zuiverheid te bereiken.

Daarom wilden we de celsorteertechnologie implementeren om deze nieuwe benadering op basis van extracellulaire blaasjes te bestuderen, te karakteriseren en uiteindelijk te vertalen naar de klinische praktijk. Ons protocol bestaat uit vier delen: de monstervoorbereiding, karakterisering van extracellulaire blaasjes, sortering en analyse na sortering. We zullen ons concentreren op het sorteergedeelte. Zoals u zult zien, worden sommige opdrachten uitgevoerd op de sorteersoftware, terwijl andere op het aanraakscherm worden uitgevoerd.

Ons protocol biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van andere methoden van EV-scheiding. Ten eerste behoudt het gebruik van 70 micro-nozzles bij 35 psi de integriteit van EV-nasortering. Dan is het mogelijk om een specifieke populatie van EV te isoleren en ten slotte maakt het instrument het mogelijk om de sorteerinstelling op te slaan om het proces reproduceerbaar te maken.

In ons lab werken we aan de ontwikkeling van een nieuw meerkleurig paneel voor de analyse van extracellulaire blaasjes. We richten ons met name op de opstelling van het instrument en op de studie van fluorochromen. Wij zijn van mening dat het kunnen identificeren en scheiden van zeldzame populaties van blaasjes, een goede verbetering kan opleveren voor hun karakterisering en ook voor de studie van hun rol in biologische processen.

Open om te beginnen de drukleiding en het vacuümsysteem van de celsorteerder. Schakel het instrument in, open de bioveiligheidskast en start de sorteersoftware. Breng het fluïdische systeem onder druk en schakel vervolgens het fluïdische systeem in.

Activeer druppelaandrijving van het piëzo-elektrische kristal in het mondstuk dat trilt om druppeltjes te genereren. Voer de ontborrelprocedure uit om luchtbellen in het systeem te verwijderen. Laat vervolgens een buis van vijf milliliter reinigingsoplossing gedurende vijf minuten met een hoog drukverschil draaien, gevolgd door een buis van vijf milliliter gedeïoniseerd water gedurende vijf minuten.

Om de handmatige opstartprocedure uit te voeren, gaat u naar het tabblad laserbesturing en schakelt u het laservermogen in. Onderzoek de verticale uitlijning van de stroom. Druk voor het bepalen van de laservlek op het tabblad Laserstroom onderscheppen.

Klik op de groene pijlknop en volg de instructies op het touchscreen. Initialiseer IntelliSort en stel de frequentie van de drop-drive in samen met de standaardamplitudewaarde die ervoor zorgt dat de stream een druppel vormt. Voor de fijne laseruitlijningsprocedure laadt u een buis van vijf milliliter QC-uitlijningsparels in de sampler en voert u deze uit in het QC-protocol.

Selecteer op het tabblad Fijne uitlijning de gewenste parameters op de X- en Y-as om goed verdichte en gecollumeerde kralen te visualiseren. Zodra de handmatige uitlijning is gecontroleerd, voert u de automatische QC uit met de diameter van de QC-kralen ingesteld op drie micrometer. Sla de QC-acquisitie op in het software-uitlijningsprotocol.

Om de IntelliSort af te ronden, plaatst u de afbuigplaten op de juiste positie in de sorteerder en zet u de spanning aan op ongeveer 3.000 volt. Kies de sorteeruitvoer van de zes-buishouder. Selecteer de streams op de streamindicator om ze in te schakelen en voer de teststream uit.

Schakel de IntelliSort automatische drop-delay-bepalingsknop in om de juiste drop-delay in te stellen en de streams opnieuw te verifiëren. Activeer vervolgens de IntelliSort-onderhoudsmodus en controleer de valvertraging handmatig. Laad het handmatige drop-delay-protocol in de sorteersoftware en verkrijg fluorescerende controlekralen.

Nadat u de juiste diahouder hebt geplaatst, selecteert u sorteren, gevolgd door de wizard voor valvertraging en sorteerlogica. Controleer met een fluorescerende microscoop of 97% van de fluorescerende parels aanwezig is op de vijfde plas. Stel om te beginnen de celsorteerder in en activeer IntelliSort.

Voer na het uitvoeren van de scatterkalibratie de stappen voor het verzamelen van monsters uit voor elk monster. Als u een nieuw protocol voor het sorteren van monsters wilt maken, selecteert u bestand gevolgd door protocol en nieuw op de werkbalk. Klik op de instelling voor gegevensverzameling in de sorteersoftware.

Selecteer in het acquisitieparametervenster de kanalen die u interesseren en schakel de andere uit. Plaats vervolgens een tube van vijf milliliter van het monster in de sampler. Klik op het aanraakscherm op de laadknop.

Selecteer op de werkbalk van de sorteersoftware de optie acquisitie en druk op start. Wanneer het venster met voorbeeldeigenschappen wordt weergegeven, voegt u de voorbeeldnaam in en klikt u op OK. Selecteer voor het maken van de poortstrategie histogram en vervolgens histogram.

Maak drie puntdiagrammen, de eerste met een logboek 488-FSC1-hoogte op de X-as en een logboek 488-SSC-hoogte op de Y-as. De tweede met 488-FSC-2 hoogtelog op de X-as en 488-SSC-Height log op de Y-as, en de derde met 488 513 x 26 CFSE-hoogtelog op de X-as en 488-SSC hoogtelog op de Y-as. Klik op acquisitie gevolgd door start en voer de naam van het voorbeeld in.

Teken tijdens de acquisitie een regio die de CFSE-negatieve gebeurtenissen identificeert en een regio die de CFSE-positieve gebeurtenissen identificeert. Identificeer vervolgens op het tabblad Sorteren de regio die moet worden gesorteerd. Als het debiet stabiel is, selecteert u acquisitie gevolgd door stop.

Begin met sorteren door sorteren te selecteren op de werkbalk van de sorteersoftware. Als u de sorteerinstellingen wilt opslaan, selecteert u sorteren op de werkbalk en klikt u vervolgens op sorteerinstellingen opslaan. Om de zuiverheid van de gesorteerde populatie te controleren, koopt u eerst een buis van vijf milliliter reinigingsoplossing gedurende 10 minuten bij een hoog drukverschil, gevolgd door een buis van vijf milliliter gedeïoniseerd water gedurende 10 minuten.

Verkrijg 0,22 micrometer, gefilterde PBS en controleer of er geen CFSE-positieve gebeurtenissen aanwezig zijn. Verdun vervolgens vijf microliter van het gesorteerde monster in 100 microliter 0,22 micrometer, gefilterd PBS. Verkrijg de gesorteerde monsters en noteer de volumes Expressie van CD9, CD63, CD81 en CD44 in de van vet afgeleide extracellulaire blaasjes veranderde niet na CFSE-sortering.

Analyse van het volgen van nanodeeltjes toonde aan dat de grootteverdeling van de blaasjes consistent bleef voor en na het sorteren. Transmissie-elektronenmicroscopie-analyse gaf aan dat de morfologie van de blaasjes niet significant was veranderd door het sorteerproces. Bovendien was de behandeling 0,1%Triton X-100 verminderde het aantal CFSE-positieve blaasjes die hun vesiculaire oorsprong bevestigen.