Cytometrische analyse van extracellulaire blaasjes van cel-geconditioneerd Media stromen

Extracellulaire vesicles worden steeds vaker gebruikt als een diagnostische biomarker en potentiële therapeutische tool op vele veld. Flow Cytometric is de meest rechttoe rechtaan analytische methode voor het karakteriseren door pak geconfronteerd markers dit protocol kan worden gebruikt bij het analyseren van een assized deeltje, is snel, en is van toepassing op conventionele seismometers zonder de noodzaak van speciale instelling of het speciale instrument. Hoewel dit protocol wordt gebruikt om extracellulaire vesikels te categoriseren van genoemde aandoening en medium, kan het worden uitgebreid naar categorisering van bloed aangekomen AVs, ter vervanging van invasieve weefselbiopten bij patiënten.

Voor onderzoekers die nieuw zijn in het protocol, is het van cruciaal belang om stappen uit te voeren die in de sectie set-upmethode worden beschreven, en om de aangetoonde opsporingsstrategieën op de voet te volgen Begin met het coaten van 55 centimeter kwadraat Petri-gerechten met 02%varkenshuidgelatine, in PBS. Na 15 minuten was je de schotel en plaat 4,4 keer 10 tot de vijfde hartvererver cellen op elk gerecht in 7 milliliter van Iscove's Modified Dulbecco's Medium, of IMDM, aangevuld met 20%foetaal runderserum, en 1%penicilline en streptomycine voor hun incubatie bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Wanneer de cellen ongeveer 80% samenvloeiing bereiken, was de culturen twee keer met Dulbecco's PBS zonder calcium en magnesium en voer de cellen met 10 milileters serumvrij exosoomproductiemedium.

Vermeer na 7 dagen het geconditioneerde medium van elke plaat in één polypropyleencentrifugebuis en centrifugeer het medium om celafval te verwijderen. Breng de supernatent in een 100 kilodalton centrifuge filter buis, En concentraat de gewist, geconditioneerd, medium met een extra centrifugatie. Breng het concentraat in een microcentrifugebuis voor een laatste benchtop centrifugatie en voeg de supernatent toe in een polycarbonaat dikke wandmicrocentrifugebuis.

Vul de buis met PBS, tot een uiteindelijk volume van 3,2 milileters, en laad het monster in een titanium vaste angeled rotor. Laad vervolgens de rotor in een tafelblad ultracentrifuge voor ultracentrifugatie, en resuspend de pellet in 100 microliters van verse PBS. Voor nanodeeltjestracking en analyse kwantificering verdunt u 1 microliter van het ultracentrifuged monster, in 999 microliters PBS, en laad het monster in een 1 milileter spuit zonder bellen.

Laad de spuit in de inlaatpoort van de onderzoekskamer en zet de laser aan. Gebruik de opnameknop om de camera te openen en de scherpstelling aan te passen. Neem vervolgens ten minste drie verschillende frames van elk 60 seconden op en gebruik de batchprocesoptie in de software om de drie verschillende acquisities te analyseren.

Om het monster voor te bereiden op de verwerving, voeg eerst de juiste experimentele monoklonale antilichaam geconjugeerde vangkralen toe met een verhouding van 1:1:1, in een microcentrifugebuis en draaikolk de resulterende vangkralen. Voeg vervolgens het juiste volume van het monster toe aan 1 microliter van de afvang van de kraal om een 1 keer 10 te genereren tot de 8 deeltjes plus 1,2 keer 10 tot de 5e kralen per testconcentratie. Voeg 1 microliter kralen toe aan een buis met het label kralen als de negatieve controle, en pas het volume in elke buis aan op 100 microliters met verse PBS.

Plaats vervolgens de buizen in een thermomixer, met schudden, op 400 rotaties per minuut, en 4 tot 10 Celsius, 's nachts. De volgende dag, breng de monsters naar een ronde bodem 96 goed plaat, en voeg de juiste florescence geconjugeerde antilichamen aan elke put. Na een incubatie van 1 uur bij 4 tot 10 graden Celsius voegt u 100 microliters PBS toe aan elke put en opent u de acquisitiesoftware.

Selecteer cytometer- en systeemopstartprogramma om het instrument te starten en een nieuw experiment te openen. Maak een experimentele sjabloon en selecteer plaat en voeg plaat toe. Selecteer de positie van de monsters op de plaat en klik ook op set als voorbeeld.

Voer de voorbeeldnaam in de naamgevingsregels in, open het kanaaltabblad en selecteer de juiste floessiesignaalkanalen. Laad nu de plaat in het instrument. En klik op puntplot, om een nieuw voorwaarts strooigebied versus zijverstringsgebied puntplot te maken.

Selecteer initialiseren om de laser en de fluidics te starten en klik op uitvoeren om de acquisitie te starten. Pas de schaal aan om de populatie in het midden van de voorwaartse versus zijverstrooiingsplot weer te geven en teken een kralenpoort rond de hele steekproefpopulatie om het puin uit te sluiten. Klik op stop en puntplot om een voorwaartse spreidingshoogte te maken versus het puntpuntplot voor voorwaartse verspreidingsgebied en poort het monster op de kralenpopulatie.

Teken een nieuwe poort rond de grotere bevolking en noem het Singlets, en klik op punt plot om een fluorescerend signaal versus kant scatter gebied dot plot te creëren, per experimentele fluorofolaat gebruikt. Gate de nieuwe stip plot op de Singlets. Selecteer vervolgens het aantal gebeurtenissen dat u wilt opnemen en selecteer record om de experimentele acquisitie te starten.

Aan het einde van de analyse laadt u de acquisitiebestanden in de juiste analysesoftware en opent u een nieuw protocol. Maak stipplospunten voor elk bestand zoals dat zojuist is aangetoond en stel alle spreidingsas in op lineaire schaal en alle tl-as op logschaal. Toon vervolgens het geometrische gemiddelde van de bloei in de relevante signalenkanalen, om de volledige verandering in gemiddelde florescentieintensiteit te berekenen, in de verschillende extracellulaire blaasjespreparaten.

Na het testen van verschillende omstandigheden om de kleinste totale hoeveelheid extracellulaire vesikels in te stellen om de vroege exponentiële fase van een gemiddelde florescentieintensiteitscurve te bereiken, werd het minimumaantal deeltjes vastgesteld op 1 keer 10 tot de 8 deeltjes per kleuring. De optimale concentratie van antilichamen voor 1 keer 10 tot de 8 deeltjes om het hoogste signaal te bereiken zonder niet-specifieke antilichaambinding, werd vastgesteld op 10 microgram per milliliter voor zowel anti-CD9_FITC als anti-CD63_PE antilichamen en vijf microgram per milliliter voor het anti-CD81_PE antilichaam. Om de geschiktheid van de methode te bevestigen, voor het analyseren van cupvormige extracellulaire vikjes, en niet membraanpuin, werden de extracellulaire vikjes gesoniceerd, wat resulteerde in een afname van de gemiddelde bloeiintensiteit, na slechts 30 seconden van sonicatie, zonder dat de floresescentie na één minuut mechanische verstoring werd gedetecteerd.

X's eigen zuivering van cardiale voorlopercellen zoals aangetoond, levert extracellulaire vikjes, het uitdrukken van lage niveaus van CD9 en hoge niveaus van CD63 en CD81 van beide celpopulaties. Bovendien, terwijl X's eigen oppervlak markers zijn duidelijk herkenbaar zonder ultracentrifugatie, deze verrijking stap sterk verbetert de gemiddelde florescentie intensiteit van deze markers. Bij het werken met extracellulaire vesicles, er is meer onzorgvuldig nano deeltjes pellets kunnen gemakkelijk worden gemist.

Daarom is het essentieel om alle stappen te volgen zoals aangetoond in het protocol. Het gebruik van extracellulaire vesicles als biomarker is nu een van de meest opkomende veldonderzoek. En binnenkort, kan worden vertaald in de klinische diagnostische gebruikt als een alternatieve screening tool.