Karakterisering van extracellulaire blaasjes uit biologische vloeistoffen
28 februari 2025
Hier demonstreren we de karakteriseringsmethode voor extracellulaire blaasjes (EV's) verzameld uit biologische vloeistoffen, zoals tranen en speeksel, van menselijke proefpersonen. De scanner die bij deze methode wordt gebruikt, is in staat om het fenotype, de grootte en het totale aantal deeltjes van EV's van 1 μL van het monster te detecteren.
Extracellulaire vesicles dienen als biomarkers voor ziekten en weerspiegelen fysiologische toestanden. Onze aanpak maakt rijke data-extractie mogelijk uit kleine traanvolumes, waardoor EV-onderzoek in biologische vloeistoffen wordt geavanceerd. Belangrijke experimentele uitdagingen omvatten het verkrijgen van voldoende extracellulaire vesicleconcentraties uit kleine monsters, het minimaliseren van monsterverlies tijdens isolatie, en het optimaliseren van analyse om chipsaturatie of zwakke signaaldetectie te voorkomen.
Dit protocol omzeilt isolatie-stappen, vermindert verwerkingstijd, en maakt extracellulaire vesicles analyse mogelijk van kleine monstervolumes, waardoor het ideaal is voor beperkte biologische monsters, zoals tranen. Niet-invasieve biomarkers zijn cruciaal voor vroege detectie en beheer van corneastoornissen. Extracellulaire vesicle biomarkers maken ziektemonitoring, gepersonaliseerde behandelingen, betere patiëntnaleving, en verbeterde kwaliteit van leven mogelijk.
Ons lab was pionier in de analyse van extracellulaire vesicles in traanmonsters van KC-subjects, waarbij unieke tEV-signaturen werden geïdentificeerd. Dit baant de weg voor toekomstige diagnostiek en EV-gerichte therapeutische doelen. Om te beginnen, zet de biologische monsters en een tetraspanin chip op de werkruimte.
Pipet 70 microliter van menselijke biologische monsters die voorgemengd zijn met oplossing B van een menselijke tetraspanin kit op een chip. Plaats de film op een chipwasplaat om monsterverdamping te voorkomen. Na 16 uur, plaats de plaat in de chipwasser.
Vergrendel het op zijn plaats en sluit het deksel. Druk op de CW-TETRA v0 optie op de chipwasser. Terwijl de chips worden gewassen, bereid 300 microliter blokkeringsoplossing per chip voor.
Voeg 0,6 microliter van elk antilichaam per chip toe aan de blokkeringsoplossing. Vortex de blokkeringsoplossing met het antilichaamcocktail om een grondige menging te garanderen. Wanneer het chipwassen voltooid is, voeg 250 microliter van de blokkeringsoplossing met het antilichaamcocktail toe bovenop elke chip.
Sluit vervolgens het deksel en druk op Doorgaan. Wanneer de chipwasser tjilpt, verwijder de chipwasplaat. Verplaats de chips omhoog over de oprit.
Plaats de plaat terug in de chipwasser, zorg ervoor dat deze veilig op zijn plaats vergrendelt. Sluit het deksel en druk op Doorgaan. Om te beginnen, zet een nanodeeltjesanalysator aan.
Start het scansoftwareprogramma op het bureaublad verbonden met de nanodeeltjesanalysator. Selecteer de chipmap om elke tetraspanin chip te kiezen en lokaliseer deze in Chipspositie op de chuck. Klik op de drie vierkanten onder Chipspositie om de fluorescentie aan te zetten.
De vierkanten worden geel, blauw en rood. Druk op het chuckdeksel en trek het om het te verwijderen. Bevestig vervolgens de monstergeladen tetraspanin chips stevig op de chuck.
Lign de pinnen van het chuckdeksel met de gaten en druk naar beneden. Schuif het deksel om het op zijn plaats te vergrendelen. Plaats vervolgens de chuck op het stadium en vergrendel deze op zijn plaats.
Klik vervolgens op Chips scannen vanuit de softwareinterface, klik vervolgens op OK. Zodra het stadium volledig in de machine beweegt, sluit de deur. Wanneer de scan voltooid is, open de deur om het stadium uit te werpen en controleer de resultaten. Als de scans succesvol waren, gooi de chips weg.
Plaats de volgende set chips op de chuck. Of keer de lege chuck terug naar het stadium. Verlaat de software en zet de machine uit wanneer je klaar bent.
Optimale fluorescentieniveaus van extracellulaire vesicles werden waargenomen in de CD63, CD81 en CD9 kanalen, terwijl het MIgG controlekanaal zwart bleef, wat de controlespecificiteit bevestigt. CD81 was verminderd voor biologische vloeistoffen. Geen fluorescentie in CD63, CD81 en CD9 kanalen is indicatief voor een afwezigheid van extracellulaire vesicles.
Oversaturatie van fluorescentie was duidelijk, waardoor het moeilijk werd om zinvolle gegevens te onderscheiden vanwege overmatige labeling, met name in CD63, CD81 en CD9 kanalen.
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuwe methode voor het karakteriseren van extracellulaire vesiclen (EV's) verzameld uit menselijke biologische vloeistoffen, zoals tranen en speeksel. Door gebruik te maken van een tetraspanine chip, vergemakkelijkt de aanpak de analyse van EV's uit minimale monstervolumes, waardoor de studie van niet-invasieve biomarkers voor ziektemonitoring wordt bevorderd.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Onderzoeksgebied
- Extracellulaire vesiclen
- Niet-invasieve biomarkers
- Oogziekten
Achtergrond
- EV's dienen als indicatoren van fysiologische toestanden en ziektes
- Uitdagingen omvatten lage concentraties in kleine monsters en monsterverwerkingstijd
- Belang van vroege detectie van corneastoornissen
Gebruikte methoden
- Gebruik van een tetraspanine chip voor EV-analyse
- Menselijke biologische monsters (tranen)
- Fluorescentie-gebaseerde detectie van EV-markers CD63, CD81 en CD9
Belangrijkste resultaten
- Integratie van monstervoorbereiding en analyse stappen vermindert verwerkingstijd
- Fluorescentieniveaus van EV-markers bevestigen specificiteit en aanwezigheid
- Identificatie van tEV-signaturen in traanmonsters van keratoconus-subjecten
Conclusies
- Deze methode biedt een gestroomlijnde aanpak voor EV-analyse uit kleine biologische monsters
- De bevindingen ondersteunen toekomstige diagnostiek en therapeutische doelwitten in ooggezondheid
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Characterizing extracellular vesicles (EVs) from minimal biological fluid volumes addresses a critical bottleneck in non-invasive biomarker discovery and disease monitoring. This workflow enables high-content EV phenotyping from scarce patient samples, supporting translational research and early-stage target validation. The approach enhances predictive confidence for biomarker-driven portfolio decisions in ocular and systemic disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EV-based biomarkers for disease-relevant pathway analysis.
- Supports functional target validation by quantifying EV phenotypes from patient-derived fluids.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking EV signatures to physiological states.
Screening & Assay Development
- Prepares validated EV detection systems for downstream screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible EV marker measurements from as little as 1 μL of sample.
- Standardizes assay conditions to minimize sample loss and maximize data quality.
Translational & Preclinical Research
- Aligns non-invasive EV biomarker analysis with disease monitoring strategies.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation using patient-derived fluids.
- Supports risk-adjusted advancement of biomarker-driven therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This EV characterization protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early biomarker identification with translational validation in limited-sample contexts.
- Discovery Biology: Provides robust hypothesis testing for EV biomarker relevance in disease states.
- Screening: Offers reproducible, quantitative EV marker readouts for assay development.
- Analytics: Delivers particle count, size, and phenotype data to compare biological conditions.
- Translational Research: Connects non-invasive sample analysis to preclinical biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable platform for EV analysis across diverse biological fluids.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EV biomarker discovery and target validation.
- Operational Value: Reduces sample requirements and processing time while enhancing reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for biomarker-driven programs and reduces late-stage risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of non-invasive biomarker assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EV biology and fluorescence-based detection systems.
- Needs access to nanoparticle analyzers and tetraspanin chip technology.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data interpretation.
- Adaptable to various biological fluids with protocol optimization.
- Potential limitations include chip oversaturation and signal detection thresholds.
