Snelle fluorescentie gebaseerde karakterisering van één extracellulaire blaasjes in menselijk bloed met Nanoparticle-tracking analyse

Deze methode lost een veelvoorkomend probleem in het veld op en biedt een complete workflow voor snelle isolatie en karakterisering van enkele extracellulaire vesikles met specifieke markeringen van belang. Nanoparticle-tracking analyse is een semi-geautomatiseerde methode. Het maakt gebruik van de eigenschappen van lichtverstrooiing en Brownse beweging om de grootteverdeling van extracellulaire vikjes te analyseren.

Het aantonen van de procedure zal Vera Schmidt zijn, een promovendus van ons laboratorium. Om de extracellulaire vesikjes te isoleren, laat de monsters na het verzamelen van twee milliliter monsters van menselijk volbloed in serumscheidende buizen gedurende 15 minuten stollen bij kamertemperatuur voordat de cellen van het serum worden gescheiden door centrifugatie. Breng een milliliter serum van elk monster over in afzonderlijke 1,5 milliliter reactiebuizen voor centrifugatie om de bloedplaatjes te verwijderen en breng 100 microliter van het bloedplaatjearme plasma over naar nieuwe 1,5 milliliter reactiebuizen.

Voeg vervolgens 25 microliter exosoomnecipitatieoplossing toe aan het plasma en de vortex van de monsters grondig. Na een incubatie van 30 minuten op ijs, verzamel de extracellulaire vikjes door centrifugatie. De pellet zal verschijnen als een beige of witte kleur.

Aspirate de supernatant en centrifugeren het monster opnieuw. Verwijder vervolgens alle trances van vloeistof en resuspend de pellet in 100 microliters van PBS. Om de celmembranen van de vesicles te bevlekken, voeg 10 microliter van de EV-ophanging toe aan 50 microliter vers bereide PKH67 ethanolische kleurstofoplossing en meng grondig.

Verdun na vijf minuten bij kamertemperatuur in het donker 50 microliter van de gekleurde extracellulaire vesiclesuspensie met 2,5 milliliter gedestilleerd water in een conische buis van 15 milliliter, met grondig mengen. Om de blaasjes te etiketteren met antilichamen, verdun 10 tot 20 microliter van de niet-gekleurde extracellulaire vesicle suspensie met 50 microliters gedestilleerd water in een 1,5 milliliter reactiebuis, met grondig mengen. Voeg 2,5 tot vijf microliter van het antilichaam van belang toe aan de reactiebuis, met grondig mengen, voor een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.

Breng vervolgens 50 microliter van de gelabelde adertjes over naar een conische buis van 15 milliliter met het juiste experimentele volume gedestilleerd water, met een grondige menging, zoals aangegeven in de tabel. Voordat u de gekleurde of gelabelde extracellulaire fluitjes analyseert, verplaatst u eerst het fluorescentiefilter naar het optische pad van de microscoop en camera en start u het programma, volgens de instructies op het scherm voor geautomatiseerde implementatie. Selecteer onder het tabblad Celcontrole het juiste celnummer voor fluorescentiemeting en de referentiepositie voor de optica om te bevestigen dat de laser en de microscoop een gemeenschappelijke focus hebben.

Gebruik een spuit om het celkanaal met 10 milliliter gedestilleerd water door te spoelen, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de meetcel vrij is van luchtbellen en dat luchtbellen niet in het systeem worden geïnjecteerd. Vervolgens verdun 10 microliter van 200 nanometer formaat fluorescentie-gelabelde polystyreen deeltjes in 990 microliter van gedestilleerd water en voeg 10 microliter van deze deeltjessuspensie in een 15 milliliter buis met 10 milliliter gedestilleerd water. Injecteer vervolgens 2,5 milliliter van de eerste verdunde deeltjesoplossing in het celkanaal en klik op Focus optimaliseren om de camera aan te passen.

Om het monster te meten, spoel het celkanaal meerdere keren met 10 milliliter gedestilleerd water en injecteer de gekleurde extracellulaire vesicle suspensie. Pas met de referentiepositie de juiste acquisitieparameters aan onder het tabblad Celcontrole, zoals aangegeven in de tabel. Als u het optimale gevoeligheidsbereik wilt identificeren, klikt u op Aantal deeltjes vs.

Gevoeligheid, om een curve van de gemeten deeltjes per scherm weer te geven voor de verschillende gevoeligheidsniveaus. Pas voor de parameter Sluiter de periode aan waarin het licht gedurende een bepaald interval kan passeren. Voor de parameters na de acquisition selecteert u een minimale helderheid van 20, een minimale grootte van 20 nanometer en een maximale meetgrootte van 500 nanometer.

Let op het aantal gedetecteerde deeltjes in het gezichtsveld van het display. De verstrooiingsbalk moet in de groene tot oranje, 50 tot 300 deeltjes bereik. Klik op Deeltjesdrift controleren op nulvolt en open het tabblad Meting.

Klik op Videoverwerving uitvoeren en stel het aantal experimenten in op drie tot vijf en de vertraging tussen experimenten op nul minuten. Stel het aantal afzonderlijke subvolumeposities in op 11 en het aantal meetcycli op 10 op elke meetpositie waarop de deeltjes moeten worden geanalyseerd. Selecteer vervolgens een map, maak een nieuwe bestandsnaam en klik op Ok om de meting te starten.

Open aan het einde van de analyse het tabblad Analyse om de resultaten te bekijken. Controleer vervolgens het gemiddelde aantal deeltjes per positie, het totale aantal getraceerde deeltjes en de deeltjesconcentratie, de verdelingsbreedte van de deeltjes en de waarde van het gemiddelde en de standaarddeviatie. Het gebruik van fluorescerende kralen voor de afstelling en kalibratie van de meting geeft een optimale instellingsgevoeligheid van 85%Met behulp van deze instellingen geeft de camera een scherp beeld weer en tonen herhaalde metingen een lage standaarddeviatie.

Vlekken met een cel linker kit die een fluorescerende cel linker die een groene fluorescerende kleurstof met lange, aliphatic staarten bevat in lipide gebieden van het celmembraan bevat, onthult een sterke correlatie tussen de gevoeligheid en het aantal deeltjes gemeten. Extracellulaire vesicle kleuring antilichaam tegen een eiwit van belang geeft een deeltjesverdeling van 220 tot 1, 145 nanometer, met een piek maximale grootte van 541 nanometer. Geen extracellulaire blaasjes worden gedetecteerd na antilichaam kleuring van controle vesicle-vrij water, tot een gevoeligheid dicht bij 100%Als de meting wordt gestart wanneer de drift groter is dan 5 micrometer per seconde, de individuele herhalingen vertonen duidelijke afwijkingen.

Het is belangrijk op te merken dat het gebruik van fluoresceïne isothiocyanaat als fluorchroom resulteert in onnauwkeurige en onrendrukkende metingen, omdat deze fluorofoforiër gevoelig is voor snelle fotobleaching. Dit protocol speelt in op de toonaangevende vraag van veel onderzoekers op dit gebied voor een snelle karakterisering van enkele extracellulaire vesikels, met behulp van specifieke markers. Ondanks het feit dat de methoden de afgelopen tien jaar aanzienlijk zijn verbeterd, is er nog geen gestandaardiseerd protocol voor de analyse van enkele extracellulaire akelige akelige stekels.

Ongeacht de toekomstige voortgang van het onderzoek naar extracellulaire vesiclebiologie, biedt deze methode een snel en betrouwbaar protocol voor de karakterisering van enkele extracellulaire blaasjes met behulp van specifieke markers. Omdat onze huidige protocollen geen lange verwerkingstijden of arbeidsintensieve stappen omvatten, zijn ze ook geschikt voor hoge monsterdoorvoer.