Optimalisatie van flowcytometrische sorteerparameters voor isolatie met hoge doorvoer en zuivering van kleine extracellulaire blaasjes

Dit protocol biedt een snelle en groottespecifieke oplossingsmethode voor kleine extracellulaire blaasjes door de sorteerparameters van flowcytometrie te optimaliseren. Deze optimalisaties bieden een paneel met kritische sorteerinstellingen waarmee representatieve populaties van kleine extracellulaire blaasjes kunnen worden verkregen met behulp van alleen voorwaartse verstrooiing versus grootteverstrooiing. Begin met het uitvoeren van de standaard opstartprocedure van de stroomcelsorteerder.

Schakel het apparaat in door op de opstartknop te drukken en klik vervolgens op de laseraan/uit-knop op het laserbedieningspaneel. Druk op de knop Wisseltanks in het submenu Smart Sampler om de fluidics onder druk te zetten. Gebruik een ultrasoon gereinigde straal- en luchtmondstuk van 50 micrometer en installeer deze tot aan de spuitmondassemblage.

Stel de druk in op 80 SI voor mantelvloeistof en 80,3 SI voor monsterstroom op de drukconsole. Druk op de knop voor het starten van de mantelstroom om de mantelstroom te laten stromen. Klik op de knop Bellen in het submenu Smart Sampler om automatisch gedurende 10 minuten te debubbleen en schakel het vervolgens uit.

Om de stroom uit te lijnen en de laservlek te bepalen, schakelt u het licht van de verlichtingskamer in om de stroom over de gaatjes te bekijken. Pas de micrometers omhoog en omlaag, links en rechts en voor en achter aan om de stroom op het gaatje te centreren en de stroom scherp te stellen. Open alle laserluiken, selecteer het tabblad laser- en streamonderschepping en druk vervolgens continu op de groene pijlknop als daarom wordt gevraagd om het kalibratieproces voor laseronderschepping en uitlijning van de spuitmond te voltooien.

Open het fijne laseruitlijningsscherm. Selecteer het 640 nanometer laser en 772 bar 44 bandpass kanaal als de x-as parameter en de 405 nanometer laser en 448 bar 59 bandpass kanaal als de y-as parameter. Druk op de triggerparameterkiezer en kies de forward scatter-parameter van de 488 nanometer laser.

Verdun vervolgens de regenboogfluorescerende deeltjes door één druppel toe te voegen aan één milliliter dubbel gedestilleerd water tot een uiteindelijke concentratie van één maal 10 tot de zesde kralen per milliliter. Open de deur van de monsterkamer en laad een buis met voorbereide regenboogfluorescerende deeltjes. Druk op de startmonsterknop en pas de micrometers omhoog en omlaag aan om de fluorescentie-intensiteit te optimaliseren, waardoor elk signaal zo intens mogelijk wordt.

Druk op de knop Start Quality Control of QC op het bedieningspaneel van het touchscreen om QC automatisch uit te voeren. Druk vervolgens op de IntelliSort-initialisatieknop. Het instrument past automatisch de frequentie en amplitude van druppeloscillatie aan om de valvertraging van ongeveer 25 te verkrijgen en het afbreekpunt van de druppel duidelijk te kunnen visualiseren.

Druk vervolgens op de knop voor het vertragen van de neerzet en op de knop Onderhouden. Selecteer buis als het sorteeruitvoertype. Plaats een buishouder van 15 milliliter in de sorteerkamer.

Zet de plaatspanning aan en stel de plaatspanning in op ongeveer 4.000 volt. Schakel vervolgens het testpatroon in door de knop voor het instellen van de stream te selecteren. Pas de schuifregelaar voor de laadfase en de afbuigingsschuifregelaar aan om ervoor te zorgen dat het beeld van de stroom in lijn is met de verzamelbuis.

Selecteer vervolgens de vinkjesknop. Meld u aan bij het Summit-werkstation op de computer. Maak een nieuw protocol vanuit het hoofdmenu van het bestand.

Maak vervolgens een puntplot door het histogramtabblad in het configuratiescherm van Summit Software te selecteren. Kies voorwaartse spreiding als de x-asparameter en zijspreiding als de y-asparameter. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op de as van de nieuwe puntplot in de werkruimte en presenteer de voorwaartse spreiding en zijverstrooiing in de logaritmische vorm.

Selecteer het tabblad Acquisitie en zoek het deelvenster Acquisitieparameters. Schakel alle signalen in het submenu van het inschakelen van parameters in. Kies forward scatter als triggerparameter en stel de drempel in van 0,01.

Pas de spanning en versterking van voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing aan op 250 en 0,6 om ervoor te zorgen dat gebeurtenissen binnen de voorwaartse verstrooiing versus zijverstrooiingsplot en populaties worden gescheiden. Verdun de fluorescerende polystyreenmicrosferen tot suspensies van 100, 200 en 300 nanometer door één microliter microsferen toe te voegen aan één milliliter dubbel gedestilleerd water. Laad vervolgens de microsfeersuspensie achtereenvolgens.

Selecteer Start onder het acquisitiemenu van Summit Software om 20.000 gebeurtenissen op te nemen en klik vervolgens op Stoppen na het opnemen van de gebeurtenissen. Klik met de rechtermuisknop op de voorwaartse spreidings- versus zijspreidingspuntplot om rechthoeken te maken en sleep om het formaat te wijzigen. Verplaats de gebieden van elektronische ruis en 100 nanometer microsfeerpopulatie door met de rechtermuisknop op de regio's te klikken om ze respectievelijk R7 en R4 te noemen.

Herhaal de stappen om de microsferen van 200 en 300 nanometer achtereenvolgens met rechthoeken te omlijsten en hernoem ze respectievelijk als R5 en R6. Bepaal ten slotte het sorteergebied van 50 tot 200 nanometer op basis van de elektronische ruis en de positie van 200 nanometer deeltjes om het als R8 te definiëren. Bewerk sorteerbeslissingen in het deelvenster Sorteerlogica en statistieken door te dubbelklikken op het lege veld van de linker- of L1-stream en het gebied met de naam R8 te selecteren om de sorteerlogica te maken. Kies de zuiverheidsmodus voor afbreken en selecteer een druppelomhulsel boven één druppel voor de L1-stroom.

Laad 500 microliter monster van eerder bereide extracellulaire blaasjes of EV's mengsel. Druk op de knop Start onder het acquisitiemenu in Summit om de gegevens op te halen en klik vervolgens op Stoppen. Druk vervolgens op Start in het sorteermenu om kleine extracellulaire blaasjes van 50 tot 200 nanometer of sEV in een centrifugebuis van 15 milliliter te verzamelen.

Flowcytometrie-analyse van polystyreenmicrosferen van standaardformaat om het 50 tot 200 nanometer groottebereik in de voorwaartse verstrooiing versus zijverstrooiingsplot te lokaliseren, onthulde onderscheidbare deeltjessignalen. R4, R5 en R6 verwijzen naar de posities van respectievelijk 100, 200 en 300 nanometer deeltjes. R7 is de elektronische ruis als detectiegrens voor 50 nanometer deeltjes en R8 vertegenwoordigt het positiebereik van 50 tot 200 nanometer deeltjes.

De deeltjesgrootteverdeling van het EV-mengsel afgeleid van pancreas-ééncellen door nanodeeltjestraceringsanalyse, of NTA, lag in het brede bereik van 40 tot 400 nanometer na ultracentrifugatie. Flowcytometrische sortering werd uitgevoerd om de 50 tot 200 nanometer sEV binnen het R8-gebied te isoleren en te zuiveren. De kwaliteit van de isolatie werd geverifieerd door NTA en er werd vastgesteld dat het deeltjesgroottebereik van sEV na sortering tussen 50 en 200 nanometer lag.

De aanwezigheid van sEV werd verder waargenomen door TEM en de geïsoleerde sEV's werden bevestigd dat ze markers van CD6, CD63 en CD81 bevatten door Western Blot Analysis. Deze methode maakt de scheiding van kleine extracellulaire blaasjes en de classificatie of pro tem analyse van kleine extracellulaire blaasjes genexpressie mogelijk, waardoor tal van downstream onderzoekstoepassingen worden geopend.