Technieken voor de Analyse van de extracellulaire blaasjes Met behulp van flowcytometrie

Het algemene doel van deze procedure is om de circulatie van extracellulaire blaasjes in het bloed te isoleren en te analyseren via twee verschillende methoden. Voor de methode voor individuele detectie van extracellulaire blaasjes wordt eerst platelet-poor plasma (PPP) geïsoleerd uit een bloedmonster.

De PPP wordt vervolgens gekleurd met de gewenste fluorochroom-geconjugeerde antilichamen. Voor de detectiemethode op basis van beads worden de extracellulaire blaasjes geïncubeerd met beads, waarna de aan de beads gebonden blaasjes worden gekleurd met de relevante fluorochroom-geconjugeerde antilichamen. Uiteindelijk kan de inhoud van de circulerende extracellulaire blaasjes worden bepaald door analyse van de monsters via flowcytometrie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals elektronenmicroscopie of scheiding met magnetische kralen, is dat deze veel sneller is en een beoordeling van de totale extracellulaire escal-populatie mogelijk maakt, in plaats van beperkt te zijn tot specifieke subpopulaties. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, aangezien het succes van deze methode een strikte naleving van de gedemonstreerde handelingen en de instellingsparameters van de cytometer vereist. Om kwalitatieve gegevens te produceren met minimale dagelijkse variatie, begint u met het centrifugeren van volbloedmonsters om het plasma te scheiden van de buffyjlaag en de rode bloedcellen. Breng vervolgens aliquots van 1,2 milliliter van het plasmasupernatant over in centrifugebuisjes van 1,5 milliliter, waarbij u er zorg voor draagt de onderste lagen met de buffyjlaag en de rode bloedcellen niet te verstoren; centrifugeer vervolgens het supernatant opnieuw om eventuele bloedplaatjes en grote celfragmenten te verwijderen.

Breng na afloop van het centrifugeren voorzichtig alles behalve de laatste 200 µL van de PPP-monsters over naar nieuwe buisjes, waarbij u er goed op let de pellets niet te verstoren. Meng het plasma vervolgens enkele keren door op en neer te pipetteren en breng 320 µL van elk monster over naar de bovenste rij van een 96-wells plaat. Om de monsters te kleuren, combineert u de antilichamen van belang voor elk van de drie panelen in individuele centrifugale filterbuisjes van 0,22 µm en centrifugeert u de antilichamen in een centrifuge met vaste hoek en een enkele snelheid.

Zodra alle antilichamen door het filter zijn gegaan, wordt de juiste hoeveelheid van het mengsel aan elke well van de 96-wells plaat toegevoegd, zoals afgebeeld in de figuur. Gebruik vervolgens een multikanalenpipet om de PPP-monsters te mengen en breng daarna 100 µL van elk monster over naar de antilichamen in rij twee. Meng de monsters vervolgens opnieuw, vervang de tips en breng 100 µL monster over naar elk van de volgende twee rijen met antilichamen, indien van toepassing.

Voor het experiment: incubeer de plaat bij vier graden Celsius nadat 220 µL PBS per well is toegevoegd aan rij zes tot en met acht in een biologische veiligheidskabinet. Draag vervolgens, met behulp van een multichannelpipet met instelbare breedte, de inhoud van elke well over naar de bijbehorende centrifugeerfilterbuis zonder de tips te vervangen.

Gebruik 200 µL PBS uit een van de wasrijen om de wells waarin de monsters zojuist zijn verwijderd, te spoelen. Breng de spoeloplossing vervolgens over naar dezelfde centrifugale filters waarin de PPP-monsters eerder zijn toegevoegd en sluit de centrifugale filters. Zodra alle gekleurde PPP-monsters samen met hun spoeloplossingen zijn overgebracht, worden de monsters gecentrifugeerd in een centrifuge met een vaste rotor.

Controleer na het centrifugeren of er geen vloeistof op de filters is achtergebleven. Resuspendeer vervolgens de bovenkanten van de filters in 300 µL PBS en breng de geresuspendeerde inhoud over in vooraf gelabelde buisjes voor onmiddellijke flowcytometrische analyse. Het wassen van de gekleurde monsters met behulp van centrifugale filters verbetert de scheiding tussen de achtergrond en de positieve markersignalen.

Het is echter belangrijk om op te merken dat sommige van de kleinere extracellulaire blaasjes, waaronder exosomen, verloren kunnen gaan door de poriën van het filter. Om de monsters te analyseren, stelt u eerst de parameters voor de forward- en side-scatter-voltage in op een logaritmische schaal en selecteert u de laagst mogelijke drempelwaarden die door de cytometer voor elke parameter zijn toegestaan. Pas vervolgens deze voltages aan naar de hoogste waarden die het grootste deel van de achtergrondruis uitsluiten, terwijl u een buis met 0,22 µm gefilterde PBS doorlaat. Laat daarna een buis door die een mengsel van beads van 1 µm en kleiner bevat, en trek een gate rond de bead-populatie in een forward- versus side-scatter-plot om alle events onder de 1 µm beads vast te leggen.

Stel nu de stroomsnelheid van de cytometer in op laag en gebruik de beads om de stroomsnelheidknop op de cytometer aan te passen tot de gewenste event rate. Neem vervolgens, met behulp van een buis met regenboogfluorescente partikels verdund in PBS, 5.000 events op, waarbij de gemiddelde intensiteitswaarden voor de forward scatter, side scatter en elk kleurkanaal worden geregistreerd. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, wordt elk monster precies één of twee minuten lang geanalyseerd. Nadat de eerste meting voor elke buis is voltooid, wordt 20 µL 10% MP 40 aan elk monster toegevoegd, waarna de buizen opnieuw gedurende dezelfde tijd worden uitgelezen om de positieve events die in het gelyseerde monster over een gelijke periode zijn gedetecteerd, te kunnen aftrekken.

Om extracellulaire blaasjes te detecteren via bead-gebaseerde capture, begin dan met het twee keer wassen van ongecoate polystyreen beads van zes micrometer met RPMI-medium, gevolgd door resuspensie in twee milliliters van hetzelfde medium. Voeg vervolgens 6.000 beads toe aan elke nieuwe fax-tube: aan de negatieve controlebuis worden 400 microliters medium toegevoegd, en aan alle overige buizen 200 microliters PPP of ultracentrifuge extracellulaire blaasjes, afhankelijk van de toepassing, en 200 microliters medium. Stel het eindvolume in elke buis in op 400 microliters.

Voeg meer medium toe. Incubeer de buisjes overnacht bij vier graden Celsius op een schudapparaat. Was de volgende ochtend de kralen met twee milliliter medium.

Zuig het supernatant af en blokkeer eventuele aspecifieke binding met 400 µL 5% bovine serum albumin; plaats dit op een schudapparaat bij 4 °C gedurende drie uur. Was na drie uur de kraaltjes in nog eens twee milliliter medium en resuspendeer de pellets in 100 µL vers medium. Filtreer nu de antilichamen en voeg het juiste volume gefiltreerde antilichaamcocktail toe aan elke buis, en was na 30 minuten bij 4 °C de kraaltjes in nog eens twee milliliter medium.

Resuspendeer de pellets nu in 400 µL medium en analyseer de monsters onmiddellijk via flowcytometrie, waarbij de parameters voor forward en side scatter worden ingesteld op de laagst mogelijke drempelwaarde die door de flowcytometer wordt toegestaan, zoals zojuist gedemonstreerd. Gate vervolgens op de populatie singlet beads en verzamel 2000 events per monster. Zowel de individuele detectiemethode als de bead-gebaseerde detectiemethode kan worden gebruikt om de aanwezigheid van extracellulaire vesikels in de PPP-monsters aan te tonen, zoals geïllustreerd in deze dot plots. Voor de individuele detectieanalyse wordt de gelyseerde controle gebruikt om de gates in te stellen voor het overeenkomstige, niet-geliste monster.

De meeste gebeurtenissen moeten binnen de gate voor extracellulaire vesikels vallen. In deze figuur tonen deze bi-parameterplots bijvoorbeeld de detectie van de markers CD 1 0 8 A en CD 2 35 A, twee markers voor rode bloedcellen waarvan bekend is dat ze gelijktijdig op cellen voorkomen. Zoals verwacht is meer dan de helft van de positieve gebeurtenissen op de extracellulaire vesikels positief voor beide markers, terwijl in deze bi-parameterplots de expressie van twee markers op extracellulaire vesikels die bekendstaan als niet gelijktijdig voorkomend op cellen, aparte positieve populaties vertoont bij gebruik van de bead-gebaseerde detectiemethode.

Er is geen scheiding tussen de positieve en negatieve populaties en events verschijnen in de dubbel-positieve kwadranten, ook al worden ze normaal gesproken niet op dezelfde celtypen aangetroffen, omdat beide typen extracellulaire blaasjes aan één enkele bead zullen binden. Daarom worden gegevens van deze methode bij voorkeur geanalyseerd met histogrammen waarop de gegevens van de negatieve controle zijn geprojecteerd, waarbij een duidelijke verschuiving in de markerexpressie wordt waargenomen in de bead-monsters vergeleken met de controles. Zodra deze techniek beheerst is, kan deze worden gebruikt om 12 bloedmonsters met drie antilichaampanels in drie tot vier uur te analyseren met de individuele detectiemethode, of in anderhalve dag via de bead-methode indien deze correct wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om consistent te zijn in de behandeling van elk monster en ervoor te zorgen dat de stroomsnelheid van de cytometer en de fluorescentie-intensiteiten aan het begin van elk experiment correct zijn ingesteld om overeen te komen met de experimentele instellingen van de vorige dag, vooral wanneer er meerdere monsters over meerdere dagen worden geanalyseerd.