Technieken voor de Analyse van de extracellulaire blaasjes Met behulp van flowcytometrie

Het algemene doel van deze procedure is om de circulatie van extracellulaire vesikel in het bloed te isoleren en te analyseren met behulp van twee verschillende methoden. Voor de individuele detectiemethode voor extracellulaire vesikel. Wordt eerst plasma dat arm is aan bloedplaatjes of PPP geïsoleerd uit een bloedmonster.

Het PPP wordt vervolgens gekleurd met de geconjugeerde fluorochrome antilichamen van belang. Voor de detectiemethode op basis van kralen worden de extracellulaire vesikel geïncubeerd met kralen, en vervolgens worden de kraal-gebonden vesikel gekleurd met de relevante geconjugeerde fluorochrome antilichamen. Uiteindelijk kan het circulerende extracellulaire vesikelgehalte worden bepaald door analyse van de monsters door middel van flowcytometrie.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals elektronenmicroscopie of magnetische kralenscheiding, is dat het veel sneller is en toelaat om de totale extracellulaire schaalpopulatie te beoordelen in plaats van beperkt te zijn tot specifieke subpopulaties. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen, omdat het succes van deze methode een strikte naleving vereist van de gedemonstreerde manoeuvres en cytometer-setupparameters. Om hoge kwaliteitsgegevens te produceren met minimale dag-tot-dag variatie, begint u door het centrifugeren van hele bloedmonsters om het plasma te scheiden van de Buffy-coat en rode bloedcellen. Vervolgens brengt u 1,2 milliliter aliquoten van de plasma-supernatant over in 1,5 milliliter centrifugeerbuisjes, zorg ervoor dat u de onderste lagen met de buffy-coat en de rode bloedcellen niet verstoort, en centrifugeer vervolgens de supernatant opnieuw om eventuele bloedplaatjes en grote celfragmenten te verwijderen.

Aan het einde van het centrifugeren, brengt u voorzichtig alle oplossingen behalve de laatste 200 microliter van de PPP-monsters over naar nieuwe buisjes, zorg ervoor dat u de pellets niet verstoort. Meng vervolgens het plasma enkele keren op en neer en breng 320 microliters van elk monster over naar de bovenste rij van een 96-wellplaat. Om de monsters te kleuren, combineert u de antilichamen van belang voor elk van de drie panelen in afzonderlijke centrifugale filterbuisjes van nul punt 22 micrometer en centrifugeert u de antilichamen naar beneden met behulp van een vaste hoek, enkele snelheid centrifuge.

Wanneer al het antilichaam door de filter is gegaan, voegt u de juiste hoeveelheid van het mengsel toe aan elke put van de 96-wellplaat zoals afgebeeld in de figuur. Gebruik vervolgens een multikanaals pipet om de PPP-monsters te mengen en breng vervolgens 100 microliters van elk monster over naar de antilichamen in rij twee. Meng vervolgens de monsters opnieuw, verwissel de tips en breng 100 microliters van het monster over naar elk van de volgende twee rijen antilichamen zoals van toepassing is.

Voor het experiment. Incubeer de plaat bij vier graden Celsius na 30 minuten bij 220 microliters PBS per put naar rij zes tot acht binnen een biologische veiligheidskast. Gebruik vervolgens een breedte-instelbare multikanaals pipet om de inhoud van elke put over te brengen naar de bijbehorende centrifugale filterbuis zonder de tips te verwisselen.

Gebruik 200 microliters PBS van een van de spoelrijen om de putten te spoelen waaruit de monsters net zijn verwijderd. Breng vervolgens de spoelvloeistof over naar dezelfde filters waarop eerder de PPP-monsters zijn toegevoegd, en sluit de centrifugale filters. Zodra alle gekleurde PPP-monsters zijn overgebracht samen met hun spoelvloeistoffen, centrifugeert u de monsters in een vaste rotorcentrifuge.

Zorg er na het centrifugeren voor dat er geen vloeistof op de filters achterblijft. Resuspendeer vervolgens de bovenkant van de filters in 300 microliters PBS en breng de resuspendeerde inhoud over naar vooraf gelabelde buisjes voor onmiddellijke flowcytometrische analyse. Het spoelen van de gekleurde monsters met behulp van centrifugale filters, verbetert de scheiding tussen de achtergrond en positieve markersignalen.

Het is echter belangrijk op te merken dat sommige van de kleinere extracellulaire vesikel, inclusief exosomen, verloren kunnen gaan door de deuren van de filter. Om de monsters te analyseren, stelt u eerst de voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsspanningsparameters in op een logaritmische schaal en selecteert u de laagste drempels die door de cytometer voor elke parameter worden toegestaan. Terwijl u een buisje met nul punt 22 micrometer gefilterd PBS laat lopen, past u deze spanningen aan tot de hoogste waarden die de meerderheid van de achtergrondruis uitsluiten. Vervolgens laat u een buisje met een mengsel van kralen lopen, een micrometer en kleiner, en tekent u een poort rond de kralenpopulatie in een voorwaartse bij zijwaartse verstrooiingsplot om alle gebeurtenissen onder de kralen van één micrometer te vangen.

Stel nu de flow-snelheid van de cytometer laag in en gebruik de kralen om de flow-snelheidsknop op de cytometer in te stellen op de gewenste gebeurtenissnelheid. Gebruik vervolgens een buisje met regenboogfluorescente deeltjes verdund in PBS om 5.000 gebeurtenissen te verwerven, waarbij de gemiddelde intensiteit van de waarden voor de voorwaartse verstrooiingszijwaartse verstrooiing en elk kleurkanaal wordt geregistreerd. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, laat u elk monster exact een of twee minuten lopen. Na de eerste meting voor elk buisje, mengt u 20 microliters van 10%MP 40 in elk monster en leest u de buisjes opnieuw voor dezelfde hoeveelheid tijd om de aftrekking van de positieve gebeurtenissen die in het gelyseerd monster zijn gedetecteerd gedurende een gelijke periode van tijd mogelijk te maken.

Om de extracellulaire vesikel te detecteren door middel van kralen-gebaseerde opvang, begint u met het wassen van ongecoate zes micrometer polystyreenkralen twee keer met RPMI-medium, gevolgd door het opnieuw oplossen in twee milliliter van hetzelfde. Voeg vervolgens 6.000 kralen toe aan elke nieuwe faxbuis tot de negatieve controlebuis op 400 microliters medium tot alle andere buisjes op 200 microliters PPP of ultracentrifuge extracellulaire vesikel zoals van toepassing, en 200 microliters medium. Pas het eindvolume in elke buis aan tot 400 microliters.

Met meer medium. Incubeer de buisjes een