Name: Verkrijging en decellularisatie van Rat Hindlimbs met behulp van een ex vivo perfusie-gebaseerde bioreactor voor gevasculariseerde composiet allotransplantatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Leer decellularisatie van rattenachterpoten met een ex vivo perfusiebioreactor voor gevasculariseerde composietallotransplantatie. Deze methode vermindert weefselimmunogeniciteit en verbetert transplantatieuitkomsten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Figuur 3A is gemaakt in BioRender.com.

Cadaverische mannelijke Lewisratten (300-430 g) verkregen van het Toronto General Hospital Research Institute werden gebruikt voor alle experimenten. Voor alle chirurgische ingrepen werden steriele instrumenten en benodigdheden gebruikt om de aseptische techniek te behouden (zie de Tabel van Materialen). Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Animal Care Committee van het Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network (Toronto, ON, Canada). In totaal werden vier achterpoten gedecellulariseerd.
1. Prechirurgische bereiding
<ol><li>Bereid 50 ml 5% gehepariniseerde zoutoplossing. Haal uit een zoutzak van 50 ml 2,5 ml zoutoplossing met een spuit van 5 ml en gooi deze weg. Voeg met een spuit van 5 ml 2,5 ml heparine toe aan de zoutzak. Keer de zoutzak om om de inhoud ervan te mengen.</li>
	<li>Plaats een cadaverische rat in rugligging onder een blauwe pad. Scheer de achterwand en liesstreek om de hoek met een elektrisch scheerapparaat en verwijder het haar.</li>
	<li>Breng de rat naar het operatiestation en breng Povidone jodium scrub oplossing aan met behulp van een gaasje op de achter- en liesstreek. Breng vervolgens 70% isopropylalcohol aan om de scruboplossing met gaas af te vegen.</li>
	<li>Gooi de blauwe pad uit stap 1.2 weg en verander in nieuwe, steriele handschoenen.</li>
</ol>2. Verkrijging van rat hindlimb
<ol><li>Maak een huidincisie met behulp van een # 10 chirurgisch mes en een # 3 blade runner langs het niveau van het inguinale ligament, van een laterale naar een mediale richting (figuur 1A). Gebruik adson tang om de omliggende huid vast te houden om een gladde incisie te garanderen.</li>
	<li>Wanneer het onderliggende vet wordt blootgesteld, gebruik dan stompe dissectie om zorgvuldig door het vet te ontleden. Lokaliseer de superieure epigastrische vaten.</li>
	<li>Gebruik microscissors om proximaal te ontleden en de onderliggende femorale zenuw, slagader en ader bloot te leggen op het niveau van het inguinale ligament.</li>
	<li>Identificeer onder een dissectiemicroscoop de femorale vaten en ontleed de slagader en ader proximaal met behulp van een fijne tang om voldoende lengte te verkrijgen van de bifurcatiepunten van het arteriële netwerk (figuur 1B).</li>
	<li>Ligaat de dijbeenslagader en ader afzonderlijk met behulp van 6-0 hechtingen.</li>
	<li>Voer circumferentiële dissectie uit rond de rest van de achterste zonder de ligamb te verstoren.</li>
	<li>Transect het femorale bot halverwege de lengte met behulp van een botsnijder.</li>
	<li>Om de achterste stroming volledig te isoleren, transect de geligeerde femorale vaten onder de ligaturen met behulp van microscissors.</li>
	<li>Kan de dijbeenslagader met behulp van een 24 G angiocatheter onder de dissectiemicroscoop. Gebruik een fijne tang om de canule voorzichtig in te brengen. Spoel met gehepariniseerde zoutoplossing totdat een duidelijke uitstroom uit de femorale ader wordt waargenomen.</li>
	<li>Bevestig de canule door één hechting rond het gecannuleerde vat en een andere hechting distaal rond de canule zelf te binden. Zorg ervoor dat de canule proximaal wordt geplaatst om te voorkomen dat de bifurcatiepunten worden geblokkeerd.</li>
	<li>Dompel de verkregen achterpoten onder in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) tot decellularisatie.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64069/64069fig01.jpg"> Figuur 1: Inkoop van rattenachtervel. (A) Markering van de huidincisie op het niveau van het inguinale ligament van lateraal tot mediaal. (B) Zicht op de femorale ader en de dijbeenslagader, die proximaal zijn ontleed in de richting van het liesband, aangegeven door de stippellijn. Afkortingen: L = lateraal; M = mediaal; FV = femorale ader; FA = dijbeenslagader. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64069/64069fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
3. Bereiding van oplossingen
<ol><li>Bereid in een glazen kolf van 6 L een reinigingsmiddelreservoir van 5 L van 0,25% natriumdodecylsulfaat (SDS) door 12,5 g SDS-poeder op te lossen in 5 L ultrapuur gedestilleerd water. Bedek de opening van de kolf met parafilm om deze af te dichten.</li>
	<li>Bereid in een glazen pot van 1 L 1 L 0,25% SDS-oplossing afzonderlijk door 2,5 g SDS op te lossen in 1 L ultrapuur gedestilleerd water. Voeg een roerstaaf toe om de oplossing op een magneetroerder te mengen totdat alle SDS is opgelost.</li>
	<li>Bereid 1 l 1x PBS-wasoplossing met 1% antibioticum-antimycotische (AA) oplossing. Voeg in een kolf van 1 L 990 ml 1x PBS-oplossing en 10 ml AA toe.</li>
	<li>Bereid afzonderlijk, in een glazen pot van 500 ml, 1x PBS + 1% AA-oplossing opnieuw met 495 ml 1x PBS-oplossing en 5 ml AA.</li>
	<li>Bereid 200 ml 1% perazijnzuur (PAA)/4% ethanol (EtOH) oplossing. Bereid deze oplossing onder een zuurkast.</li>
</ol>4. Bioreactor en perfusiecircuit constructie
OPMERKING: Raadpleeg figuur 2 voor de configuratie van de bioreactor en het perfusiecircuit in de vermelde stappen.
<ol><li>Boor in een kamer van 500 ml (plastic container) drie gaten (1/4 inch) op de gelabelde locaties in figuur 2: poort A is de inlaatlijn, poort B is de vullijn en poort C is de uitlaatlijn. Verwijder en gooi overtollig plastic weg. Spuit en veeg de kamer af met 70% ethanol.</li>
	<li>Snijd drie 5 cm lange siliconen buisjes en steek er een half in elke poort van de kamer. Sluit een mannelijke Luer-connector aan op de opening van poort A aan de binnenkant van de kamer en een vrouwelijke Luer-connector aan het andere uiteinde van de buis buiten de kamer.</li>
	<li>Sluit een vrouwelijke Luer-connector aan op poort B en poort C aan de uiteinden van de buizen die uit de kamer zijn gericht.</li>
	<li>Boor in een luchtdicht deksel voor de plastic container één gat op het oppervlak van het deksel.</li>
	<li>Snijd een siliconen buis van 3 cm en steek deze in het gat van het deksel. Zorg ervoor dat ongeveer 2 cm van de buis zich uit het deksel bevindt, zoals weergegeven in figuur 2.</li>
	<li>Steriliseer zowel de kamer als het deksel met de slang.</li>
	<li>Knip twee siliconen buisjes van 30 cm met een schaar. Sluit een 1/16 in aan op een 1/8 in connector aan één uiteinde van elke buis.</li>
	<li>Knip afzonderlijk twee siliconenbuizen van 12 cm met een schaar. Sluit een 1/16 in aan op een 1/8 in connector aan het ene uiteinde van beide buizen. Sluit een mannelijke Luer-connector aan het andere uiteinde van de ene buis en een vrouwelijke Luer-connector aan op de andere buis.</li>
	<li>Steriliseer al het slangmateriaal uit stap 4.7 en stap 4.8. Neem twee 3-stop pompslangen (1,85 mm) op in de sterilisatie.</li>
	<li>Bereid drie 3-weg stopkranen, een spuitfilter, twee serologische pipetten van 1 ml en een spuit van 10 ml voor de decellularisatie-opstelling. Verwijder het filter uit de serologische pipetten van 1 ml.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64069/64069fig02.jpg"> Figuur 2: Voorbereiding van de bouw van bioreactoren en perfusiecircuits. Afgebeelde apparatuur van het perfusiecircuit, met inbegrip van (A) peristaltische pomp en (B) overeenkomstige cassettes voor zowel inlaat- als uitlaatleidingen. (C, D) Siliconen slangen van 12 cm en 30 cm worden ook weergegeven met respectievelijke connectoren. (E) Buizen voor peristaltische pomp (1,85 mm). Bioreactorkamer met gelabelde poorten voor (F) instroom, (G) vulpoort en (H) uitstroom. (I) Bioreactordeksel weergegeven met ventilatiepoort. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64069/64069fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
5. Decellularisatie van rattenachterpoten
<ol><li>Plaats de gesteriliseerde kamer en schroef op drie 3-weg stopkranen voor eenmalig gebruik bij de inlaat-, uitlaat- en bijvulleidingen. Zorg ervoor dat de stopkraan voor de vulpoort is afgedekt op de resterende twee poorten om lekkage te voorkomen.</li>
	<li>Bevestig de in stap 4.8 gemaakte buizen aan de stopkranen bij de inlaat- en uitlaatleidingen.</li>
	<li>Sluit peristaltische buizen aan op de buizen in de bovenstaande stap. Bevestig de cassette op de peristaltische slang en plaats deze op de peristaltische pomp. Zet de cassettes nog niet vast met slangen.</li>
	<li>Sluit één buis van stap 4.7 aan op het einde van de peristaltische buis van de uitlaatlijn vanaf de bovenstaande stap. Sluit een serologische pipet van 1 ml aan het andere uiteinde aan. Hang het uiteinde bevestigd met een serologische pipet in de kolf van het afvalreservoir.</li>
	<li>Herhaal stap 4.7 voor de inlaatlijn. Hang het uiteinde van de buis dat aan de serologische pipet is bevestigd in het reinigingsmiddelreservoir. Sluit de opening van de kolf van het reinigingsreservoir onmiddellijk af met parafilm. Zie figuur 3A,B voor een overzicht van het decellularisatiecircuit.</li>
	<li>Voeg 0,25% SDS uit de glazen pot van 1 L (stap 3.2) halverwege toe aan de bioreactorkamer.</li>
	<li>Neem de verkregen achterklep met behulp van een Adson-tang en hang deze voorzichtig in de bioreactorkamer.</li>
	<li>Gebruik twee paar Adson-tangen om het gecannuleerde deel van de achterste naar de inlaatlijn te leiden. Terwijl u de canule met één tang vasthoudt, gebruikt u de andere tang om de inlaatlijn aan de canule te draaien en vast te zetten. Zorg ervoor dat de canule niet wordt getrokken of gedraaid om decannulatie te voorkomen.</li>
	<li>Eenmaal vastgezet, voegt u meer 0,25% SDS toe uit de glazen pot van 1 L om de ledemaat volledig onder te dompelen, indien nodig. Zorg ervoor dat de uitlaatpoort ook ondergedompeld is in het bioreactorreservoir om ervoor te zorgen dat een consistente uitstroom wordt gehandhaafd (figuur 3C).</li>
	<li>Bevestig een spuitfilter voor eenmalig gebruik op de ventilatiepoort op het deksel van de bioreactorkamer, verwijzend naar stap 4.4 en stap 4.5.</li>
	<li>Bevestig het deksel van de bioreactor en zorg ervoor dat de kamer van alle kanten is afgesloten (figuur 3B).</li>
	<li>Om lucht uit de slang te verwijderen en het perfusiecircuit te primen, gebruikt u een nieuwe spuit voor eenmalig gebruik van 10 ml om reinigingsmiddel uit het reinigingsmiddelreservoir te halen met behulp van de 3-weg stopkraan bij de inlaatlijn.</li>
	<li>Eenmaal getekend, gebruik dezelfde vloeistof om in de 3-weg stopkraan aan de uitlaatlijn te steken. Zorg ervoor dat er wasmiddel aanwezig is in de slang bij zowel de inlaat- als de uitlaatleidingen.</li>
	<li>Druk de cassettes met de slang in de peristaltische pomp en bevestig deze vast. Schakel de peristaltische pomp in met de aan/uit-knop.<ol><li>Ga op het peristaltische pompscherm naar het tweede tabblad met behulp van de pijltoets om de perfusiesnelheid voor het eerste kanaal in te stellen. Invoerdebiet als de wijze van afgifte en stel de perfusiesnelheid in op 1 ml/min. Zorg ervoor dat de stroomrichting correct is volgens de opstelling van het apparaat. Herhaal dit voor het tweede kanaal.</li>
		<li>Kalibreer de peristaltische pomp om ervoor te zorgen dat de hoeveelheid vloeistof die door de inlaatleiding wordt afgegeven en/of uit de uitlaatleiding wordt gehaald, met een consistente snelheid tussen de twee stroomt. Zorg ervoor dat de buis-ID is ingesteld op 1,85 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Begin met decellularisatie via machineperfusie op 1 ml /min voor zowel de inlaat- als de uitlaatlijnen door op de aan / uit-knop op het toetsenbord te drukken. Controleer en zorg ervoor dat de stroom consistent en continu is bij zowel de inlaat- als de uitlaatleidingen.</li>
	<li>Ga door met decellularisatie en controleer dagelijks. Gebruik de 1 L van 0,25% SDS (stap 3.2) om het bioreactorreservoir indien nodig aan te vullen via de vulpoort. Zoek naar een wit, doorschijnend uiterlijk van het weefsel, dat op dag 5 zal verschijnen, wat wijst op decellularisatie van de achterpoten van de rat.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64069/64069fig03.jpg"> Figuur 3: Overzicht van het perfusie decellularisatie bioreactor circuit van rat hindlimb. (A) Schematische weergave van bioreactor perfusie circuit. Blauwe pijlen geven de richting van de wasmiddel- en afvalstroom aan. (B) Overzicht van het decellularisatiecircuit met bioreactor met rattenachterhoek. Het SDS-reservoir (linkerkolf) leidt naar de peristaltische pomp en naar de inlaatbuis van de bioreactor. De uitstroom wordt via de peristaltische pomp verbonden met het afvalreservoir (rechterkolf). (C) (I) Bioreactor met rattenachterwand met inlaatbuizen verbonden met de gecannuleerde dijbeenslagader. (II) In de hoek gelegen aanvullingspoort voor het perfuseren van reinigingsmiddel. (III) Uitstroombuizen opgehangen in het suspensiereservoir. Afkorting: SDS = sodium dodecyl sulfate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64069/64069fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
6. Wassen en steriliseren na decellularisatie
<ol><li>Na de bevestiging van decellularisatie, vervangt u het reinigingsmiddelreservoir door het 1x PBS + 1% AA-reservoir. Sluit de opening van de kolf af met parafilm. Begin 1x PBS + 1% AA-perfusie bij 1 ml / min en ga 2 dagen door.</li>
	<li>Vervang het 1x PBS + 1% AA reservoir door 200 ml 0,1% PAA/4% EtOH reservoir en begin met perfusie bij 1 ml/min gedurende 2 uur.</li>
	<li>Koppel de achterklep los van de inlaatlijn met behulp van twee paar steriele Adson-tangen, waarbij één paar tangen de inlaatlijn draaien en de andere de canule vasthoudt. Zorg ervoor dat de canule niet wordt getrokken om decannulatie te voorkomen.</li>
	<li>Bewaar de ledemaat in een glazen pot van 500 ml met 1x PBS + 1% AA bij 4 °C tot verder gebruik.</li>
</ol>

<ol><li>Kueckelhaus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+composite+allotransplantation%3A+Current+standards+and+novel+approaches+to+prevent+acute+rejection+and+chronic+allograft+deterioration%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration.</a> Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).</li>
<li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+a+human+face+graft%3A+The+matrix+of+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Bioengineering a human face graft: The matrix of identity.</a> Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+skin%2Fadipose+tissue+flap+matrix+for+engineering+vascularized+composite+soft+tissue+flaps%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps.</a> Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).</li>
<li>Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+implications+for+extracellular+matrix-based+technologies+in+vascularized+composite+allotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation.</a> Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).</li>
<li>Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+rat+hind+limb+transplant+as+an+experimental+model+of+vascularized+composite+allotransplantation%3A+Approaches+and+advantages%5BTitle%5D)+AND+%22SAGE+Open+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages.</a> SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871(2020).</li>
<li>Tao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterilization+and+disinfection+methods+for+decellularized+matrix+materials%3A+Review%2C+consideration+and+proposal%5BTitle%5D)+AND+%22Bioactive+Materials%22%5BJournal%5D)">Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal.</a> Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).</li>
<li>Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+decellularized+liver+scaffolds+and+recellularized+liver+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts.</a> Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).</li>
<li>Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+generation+of+bioreactors+that+advance+extracellular+matrix+modelling+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering.</a> Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).</li>
<li>Cohen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascular+chimerism+within+donor+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of vascular chimerism within donor organs.</a> Scientific Reports. 11 (1), 13437(2021).</li>
<li>Lupon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+composite+allografts+using+natural+scaffolds%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).</li>
<li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularised+skeletal+muscles+allow+functional+muscle+regeneration+by+promoting+host+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8398(2018).</li>
<li>Jank, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+composite+tissue+as+a+bioartificial+limb+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft.</a> Biomaterials. 61, 246-256 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Rattenachterpoten zijn nuttig als experimentele modellen in VCA5. Tissue engineering van acellulaire steigers is de eerste stap in het aanpakken van de tekortkomingen van langdurige immunosuppressieregimes geassocieerd met VCA. Het gebruik van composiettransplantaten vormt een extra uitdaging gezien de aanwezigheid van meerdere weefsels, elk met unieke functionele, immunogene en structurele eigenschappen. Het huidige protocol toont een succesvolle methode voor het verkrijgen van acellulaire compos...

VCA is een opkomende optie voor patiënten die een complexe chirurgische reconstructie nodig hebben. Traumatische verwondingen of tumorresecties resulteren in volumetrisch weefselverlies dat moeilijk te reconstrueren kan zijn. VCA biedt de transplantatie van meerdere weefsels zoals de huid, bot, spier, zenuwen en bloedvaten als een samengesteld transplantaat van een donor naar een ontvanger1. Ondanks het veelbelovende karakter is VCA beperkt vanwege langdurige immunosuppressieve regimes. Levenslang gebruik van dergelijke geneesmiddelen resulteert in een verhoogd risico op opportunistische infecties, maligniteiten en eindorgaantoxiciteit 1,2,3. Om de behoefte aan immunosuppressie te verminderen en / of te elimineren, zijn weefsel-gemanipuleerde steigers met behulp van decellularisatiebenaderingen voor VCA veelbelovend.
Weefseldecellularisatie houdt in dat de extracellulaire matrixstructuur behouden blijft terwijl de cellulaire en nucleaire inhoud wordt verwijderd. Deze gedecellulariseerde steiger kan opnieuw worden bevolkt met patiëntspecifieke cellen4. Het behoud van het ECM-netwerk van samengestelde weefsels is echter een extra uitdaging. Dit komt door de aanwezigheid van meerdere weefseltypen met verschillende weefseldichtheden, architecturen en anatomische locaties binnen een steiger. Het huidige protocol biedt een chirurgische techniek en een decellularisatiemethode voor een rat hindlimb. Dit is een proof-of-concept model voor het toepassen van deze tissue engineering techniek op composiet weefsels. Dit kan ook leiden tot latere inspanningen om samengestelde weefsels te regenereren door middel van recellularisatie.

<table><tbody><tr><td>0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL</td><td>Baxter Corporation</td><td>JB1308M</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Disposable Serological Pipets</td><td>VWR</td><td>75816-102</td><td></td></tr><tr><td>10 cc Disposable Syringes</td><td></td><td></td><td>Verkregen van onderzoeksinstelling</td></tr><tr><td>3-way Stopcock</td><td></td><td></td><td>Verkregen van onderzoeksinstelling</td></tr><tr><td>5cc Disposable Syringes</td><td></td><td></td><td>Verkregen van onderzoeksinstelling</td></tr><tr><td>70% Isopropyl Alcohol</td><td></td><td></td><td>Verkregen van onderzoeksinstelling</td></tr><tr><td>Acrodisc Syringe Filter 0.2 &micro;m</td><td>VWR</td><td>CA28143-310</td><td></td></tr><tr><td>Adson Forceps, Straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Angiocatheter 24 G 19 mm (&frac34;&rdquo;)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>38112</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL</td><td>Multicell</td><td>450-115-EL</td><td></td></tr><tr><td>Bone Cutter</td><td>Fine Science Tools</td><td>12029-12</td><td></td></tr><tr><td>Connectors for&nbsp; 1/16" to 1/8" Tubes</td><td>McMasterCarr</td><td>5117K52</td><td></td></tr><tr><td>Female Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID</td><td>McMasterCarr</td><td>51525K328</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps with Micro-Blunted Tips</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL</td><td>LEO Pharma Inc.</td><td>006174-09</td><td></td></tr><tr><td>Male Luer to barbed adapter (PVDF) - 1/8" ID</td><td>McMasterCarr</td><td>51525K322</td><td></td></tr><tr><td>Micro Needle Holder</td><td>WLorenz</td><td>04-4125</td><td></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>WLorenz</td><td>SP-4506</td><td></td></tr><tr><td>Peracetic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>269336-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump, 3-Channel</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-78001-68</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL</td><td>Wisent</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>Povidone Surgical Scrub Solution</td><td></td><td></td><td>Verkregen van onderzoeksinstelling</td></tr><tr><td>Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-96450-40</td><td></td></tr><tr><td>Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-96410-16</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Blade - #10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle - #3&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg</td><td>Bioshop</td><td>SDS003.1</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Suture #6-0</td><td>Covidien</td><td>VS889</td><td></td></tr></tbody></table>

verkrijging en decellularisatie van rat hindlimbs met behulp van een ex vivo perfusie-gebaseerde bioreactor voor gevasculariseerde composiet allotransplantatie

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Patiënten met ernstige traumatische verwondingen en weefselverlies vereisen een complexe chirurgische reconstructie. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is een evoluerende reconstructieve weg voor het overbrengen van meerdere weefsels als een samengestelde subeenheid. Ondanks het veelbelovende karakter van VCA, zijn de immunosuppressieve vereisten op lange termijn een significante beperking vanwege het verhoogde risico op maligniteiten, eindorgaantoxiciteit en opportunistische infecties. Tissue engineering van acellulaire composietsteigers is een potentieel alternatief om de behoefte aan immunosuppressie te verminderen. Hierin wordt de verkrijging van een rat hindlimb en de daaropvolgende decellularisatie met behulp van natriumdodecylsulfaat (SDS) beschreven. De gepresenteerde inkoopstrategie is gebaseerd op de gemeenschappelijke dijbeenslagader. Een machinaal perfusie-gebaseerd bioreactorsysteem werd gebouwd en gebruikt voor ex vivo decellularisatie van de achterste. Succesvolle perfusie decellularisatie werd uitgevoerd, resulterend in een wit doorschijnend-achtig uiterlijk van de achterste. Een intact, doorlaatbaar, vasculair netwerk in de hele achtervel werd waargenomen. Histologische analyses toonden de verwijdering van nucleaire inhoud en het behoud van weefselarchitectuur in alle weefselcompartimenten.

Het inkoopprotocol was succesvol in het isoleren en cannuleren van de gemeenschappelijke femorale slagaders voor volgende perfusiestappen. De representatieve dissectiebeelden in figuur 1A,B tonen de incisielocatie en belichting van de femorale vaten met voldoende afstand tot de bifurcatiepunten. Figuur 2 toont de apparatuur die nodig is voor de voorbereiding van de bioreactor en het perfusiecircuit. Het eindpunt van decellularisatie werd bepaald...

We beschrijven de chirurgische techniek en het decellularisatieproces voor samengestelde rattenachterpoten. Decellularisatie wordt uitgevoerd met behulp van natriumdodecylsulfaat met een lage concentratie via een ex vivo machineperfusiesysteem.

Verkrijging en decellularisatie van Rat Hindlimbs met behulp van een ex vivo perfusie-gebaseerde bioreactor voor gevasculariseerde composiet allotransplantatie

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

We hebben een klein diermodel opgesteld voor decellularisatie van een ledemaat. Dit is nuttig voor het faciliteren van proof of concept onderzoek naar de en recellularisatie van gevasculariseerde composietweefsels. Immunosuppressieregimes zijn een van de belangrijkste beperkingen bij gevasculariseerde composiet allotransplantatie.Weefselimmunogeniteit kan worden verminderd met behulp van decellularisatie. Maak om te beginnen een huidincisie met behulp van een nummer 10 chirurgisch mes langs het liesband, bewegend van een laterale naar een mediale richting, terwijl de omliggende huid wordt vastgehouden met Adson-tang. Wanneer het onderliggende vet wordt blootgesteld, gebruik dan stompe dissectie om zorgvuldig door het vet te ontleden en de superieure epigastrische vaten te lokaliseren.Gebruik een microschaar, dissecteer proximaal en leg de onderliggende femorale zenuw, slagader en ader bloot op het niveau van het inguinale ligament. Identificeer onder een dissectiemicroscoop de femorale vaten en ontleed de slagader en ader proximaal met behulp van een fijne tang om voldoende lengte te verkrijgen van de bifurcatiepunten van het arteriële netwerk. Ligaat vervolgens de femorale ader en

procurement-decellularization-rat-hindlimbs-using-an-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hier beschrijven we de orthotope rat achterste ledematen transplantatie procedure, die lijkt te zijn de gouden...

Orthotope Hind-Limb Transplantatie bij ratten

This video describes the preparation of a decellularized rat kidney. The obtained acellular vascular scaffold can serve as a promising platform for tissue engineering of organ grafts.

Preparation of Decellularized Rat Kidney: A Procedure to Generate Acellular Vascularized Whole-organ Scaffold from a Harvested Rat Kidney

Gevasculariseerde Composite Allotransplantations (VCA) hebben een klinische realiteit. Echter, brede klinische toepassing van VCA beperkt door chronische multi-drug immunosuppressie. De auteurs presenteren een betrouwbare en reproduceerbare grote diermodel om immunomodulerende strategieën die kunnen minimaliseren of potentieel elimineren de noodzaak van immunosuppressie in VCA vertalen.

Een Gemodificeerde Heterotope Varkens Hind Limb Transplant Model for Translational Gevasculariseerd Composite allotransplantatie (VCA) Onderzoek

Dit nieuwe model voor orthotope achterste ledematen transplantatie in de muis, van een niet-hechtingsmanchet techniek voor super-microvasculaire anastomose, een krachtig hulpmiddel voor in vivo mechanistische immunologisch onderzoek naar gevasculariseerd samengestelde allotransplantatie (VCA).

Orthotope Hind Limb Transplantation in de muis

Vasculaire composiet Allograft biedt levensveranderende voordelen aan transplantatie ontvangers, maar de biologische oorzaken van enten afwijzing en vasculopathie blijven slecht begrepen. De knaagdier chirurgische model hier gepresenteerd biedt een reproduceerbaar, klinisch relevant model van transplantatie, waardoor onderzoekers om afwijzing gebeurtenissen en potentiële therapeutische strategieën te evalueren om hun optreden te voorkomen.

Bewerkt Heterotopic achterpoten Osteomyocutaneous flap model in de rat voor translationele vasculaire composiet Allotransplantation onderzoek

Dit protocol presenteert een robuust, reproduceerbaar model van vascularized composiet allotransplant (VCA) gericht op gelijktijdige studie van immunologie en functioneel herstel. De tijd geïnvesteerd in zorgvuldige techniek in een rechter mid-dij achterpoot orthotopische transplantatie met de hand genaaid vasculaire anastomoses en neurale coaptatie levert de mogelijkheid om functioneel herstel te bestuderen.

Het nemen van de volgende stap: een neurale coaptatie orthotopische achterste ledemaat transplantatie model om functioneel herstel in Rat maximaliseren

We beschrijven een model van heterotopische buikharttransplantatie bij ratten, wat wijzigingen van de huidige strategieën impliceert, die leiden tot een vereenvoudigde chirurgische aanpak. Daarnaast beschrijven we een nieuw afstotingsmodel door in-ear injectie van vitale hartspiercellen, waardoor verdere transplantatie immunologische analyses bij ratten mogelijk zijn.

Een immunologisch model voor heterotopische hart- en hartspierceltransplantatie bij ratten

Dit protocol introduceert een methode om een steiger te ontwikkelen met behulp van gedecellulariseerde rattennieren. Het protocol omvat decellularisatie- en recellularisatieprocessen om de biologische beschikbaarheid te bevestigen. Decellularisatie wordt uitgevoerd met Triton X-100 en natriumdodecylsulfaat.

Voorbereiding van gedecellulariseerde niersteigers bij ratten

Dit artikel presenteert een partieel heterotopisch osteomyocutaan flaptransplantatieprotocol bij ratten en de mogelijke uitkomsten ervan in de follow-up op middellange termijn.

Partieel heterotopisch hindlimbtransplantatiemodel bij ratten

Het protocol beschrijft de chirurgische verkrijging en daaropvolgende decellularisatie van gevasculariseerde varkensflappen door de perfusie van natriumdodecylsulfaatwater door de flapvasculatuur in een aangepaste perfusiebioreactor.

Inkoop en perfusie-decellularisatie van porcine gevasculariseerde flappen in een aangepaste perfusiebioreactor

Leer decellularisatie van rattenachterpoten met een ex vivo perfusiebioreactor voor gevasculariseerde composietallotransplantatie. Deze methode vermindert weefselimmunogeniciteit en verbetert transplantatieuitkomsten.

Verkrijging en decellularisatie van Rat Hindlimbs met behulp van een ex vivo perfusie-gebaseerde bioreactor voor gevasculariseerde composiet allotransplantatie (Video) | JoVE Journal

Verkrijging en decellularisatie van Rat Hindlimbs met behulp van een ex vivo perfusie-gebaseerde bioreactor voor gevasculariseerde composiet allotransplantatie

Meer video's verkennen