Verkrijging en decellularisatie van Rat Hindlimbs met behulp van een ex vivo perfusie-gebaseerde bioreactor voor gevasculariseerde composiet allotransplantatie

We hebben een klein diermodel opgesteld voor decellularisatie van een ledemaat. Dit is nuttig voor het faciliteren van proof of concept onderzoek naar de en recellularisatie van gevasculariseerde composietweefsels. Immunosuppressieregimes zijn een van de belangrijkste beperkingen bij gevasculariseerde composiet allotransplantatie.

Weefselimmunogeniteit kan worden verminderd met behulp van decellularisatie. Maak om te beginnen een huidincisie met behulp van een nummer 10 chirurgisch mes langs het liesband, bewegend van een laterale naar een mediale richting, terwijl de omliggende huid wordt vastgehouden met Adson-tang. Wanneer het onderliggende vet wordt blootgesteld, gebruik dan stompe dissectie om zorgvuldig door het vet te ontleden en de superieure epigastrische vaten te lokaliseren.

Gebruik een microschaar, dissecteer proximaal en leg de onderliggende femorale zenuw, slagader en ader bloot op het niveau van het inguinale ligament. Identificeer onder een dissectiemicroscoop de femorale vaten en ontleed de slagader en ader proximaal met behulp van een fijne tang om voldoende lengte te verkrijgen van de bifurcatiepunten van het arteriële netwerk. Ligaat vervolgens de femorale ader en slagader afzonderlijk met behulp van 6-0 hechtingen.

Voer vervolgens circumferentiële dissectie uit rond de rest van de achterste zonder de ligatievatoren te verstoren en transect het femorale bot halverwege de lengte met behulp van een botsnijder. Om de achtervel volledig te isoleren, transeceert u de geligeerde femorale vaten distale naar de ligaturen met behulp van een microschaar en kan u de femorale slagader transecteren met behulp van een 24 gauge angiocatheter onder de dissectiemicroscoop. Spoel vervolgens met gehepariniseerde zoutoplossing totdat een duidelijke uitstroom uit de femorale ader wordt waargenomen.

Beveilig de canule door één hechting rond het gecannuleerde vat in een andere hechting distaal rond de canule zelf te binden, zodat de canule proximaal wordt geplaatst om te voorkomen dat de bifurcatiepunten worden geblokkeerd. Dompel daarna de verkregen achterpoten en PBS onder tot decellularisatie. Om de bioreactor te bouwen, plaatst u de gesteriliseerde kamer en schroeft u drie wegstopkranen voor eenmalig gebruik op de inlaat-, uitlaat- en aanvullingsleidingen, zodat de stopkraan voor de vulpoort wordt afgedekt bij de resterende twee poorten om lekkage te voorkomen.

Bevestig de eerder gemaakte siliconen buisjes aan de stopkranen bij de inlaat- en uitlaatlijnen. Sluit vervolgens peristaltische slangen aan op de siliconenbuizen. Nadat u de cassette op de peristaltische buis hebt bevestigd, plaatst u deze op de peristaltische pomp.

Sluit vervolgens een van de siliconenbuizen aan op het einde van de peristaltische buis van de uitlaatlijn vanaf de bovenstaande stap. Sluit aan het andere uiteinde een serologische pipet van één milliliter aan en resuspenseer het uiteinde dat met een serologische pipet in de kolf van het afvalreservoir is bevestigd. Hang vervolgens het uiteinde van de buis die aan de serologische pipet is bevestigd in het reinigingsmiddelreservoir en verzegel de opening van de detergentreservoirkolf onmiddellijk met parafilm.

Voeg halverwege 0,25% SDS uit de glazen pot van één liter toe aan de bioreactorkamer. Neem vervolgens de verkregen hindlimb met behulp van Adson-tang en hang deze voorzichtig in de bioreactorkamer. Gebruik twee paar Adson-tangen om het gecannuleerde deel van de achterste naar de inlaatlijn te leiden terwijl u de canule met één tang vasthoudt.

Gebruik de andere tang om de inlaatlijn aan de canule te draaien en vast te zetten. Eenmaal beveiligd, voegt u meer 0,25% SDS toe uit de glazen pot van één liter om de ledemaat indien nodig volledig onder te dompelen, zodat de uitlaatpoort ook wordt ondergedompeld in het bioreactorreservoir en een consistente uitstroom wordt gehandhaafd. Bevestig vervolgens een spuitfilter voor eenmalig gebruik op de ventilatiepoort op het deksel van de bioreactorkamer en bevestig het deksel op de bioreactor, zodat de kamer van alle kanten is afgesloten.

Om lucht uit de slang te verwijderen en het perfusiecircuit te primen, gebruikt u een nieuwe spuit voor eenmalig gebruik van 10 milliliter om reinigingsmiddel uit het reinigingsmiddelreservoir te halen met behulp van een driewegstopkraan bij de inlaatlijn. Eenmaal getrokken, gebruik dezelfde vloeistof om in de drieweg stopkraan aan de uitlaatlijn te steken. Druk vervolgens de cassettes met de slang in de peristaltische pomp en bevestig deze vast.

Schakel vervolgens de peristaltische pomp in met behulp van de aan / uit-knop. Ga op het peristaltische pompscherm naar het tweede tabblad met behulp van de pijltoets om de perfusiesnelheid voor het eerste kanaal in te stellen met het ingangsdebiet als de leveringswijze en stel de perfusiesnelheid in op één milliliter per minuut, zodat de stroomrichting correct is volgens de apparaatconfiguratie. Kalibreer de peristaltische pomp om ervoor te zorgen dat de hoeveelheid vloeistof die door de inlaatleiding wordt afgegeven en/of uit de uitlaatleiding wordt gehaald, consistent tussen de twee stroomt, zodat de slang-ID is ingesteld op 1,85 millimeter.

Begin met decellularisatie via machineperfusie met één milliliter per minuut voor zowel de inlaat- als de uitlaatlijnen door op de aan /uit-knop op het toetsenbord te drukken. Controleer en zorg ervoor dat de stroom continu is bij zowel de inlaat- als de uitlaatleidingen. Gebruik 1 liter 0,25% STS om het bioreactorreservoir indien nodig aan te vullen via de vulpoort.

Zoek vervolgens naar een wit doorschijnend uiterlijk van het weefsel, dat op dag vijf zal verschijnen, wat wijst op decellularisatie van de achterpoten van de rat. Vervang na de bevestiging van decellularisatie het reinigingsmiddelreservoir door het PBS- en 1% antibioticum-antimycotisch reservoir en sluit de opening van de kolf af met parafilm. Begin met PBS en 1% Antibioticum-Antimycotische perfusie met één milliliter per minuut en ga twee dagen door.

Vervang het PBS en 1% antibioticum-antimycotisch reservoir door 200 milliliter 0,1% parasitair zuur, 4% ethanolreservoir en begin met perfusie met één milliliter per minuut gedurende twee uur. Koppel onder een bioveiligheidskast de achterklep los van de inlaatlijn met behulp van twee paar steriele Adson-tangen met één tang om de inlaatlijn te draaien en de andere de canule vast te houden, zodat de canule niet wordt getrokken om decannulatie te voorkomen. Bewaar de ledemaat in een glazen pot van 500 milliliter met PBS en 1% antibioticum-antimycotisch bij 4 graden Celsius tot verder gebruik.

Zowel gedecellulariseerde femorale slagader als ader vertoonden verlies van nucleaire inhoud over alle lagen en het omliggende bindweefsel, gezien het gebrek aan blauw gekleurde kernen die anders aanwezig zijn in de inheemse bloedvaten. De tunica intima media en adventitia van zowel de femorale ader als de slagaders werden in de gedecellulariseerde vaten gehandhaafd. De femorale zenuw vertoonde behoud van de weefselstructuur, inclusief het endoneurium.

Het bot vertoonde algehele structurele retentie met verlies van gekleurde kernen van osteocyten en van omliggende endosteum- en periosteumlagen na decellularisatie. De huid vertoonde een verlies van cellen uit de opperhuid en dermis. De dermis vertoonde vastgehouden collageenvezels die vergelijkbaar zijn met inheems huidweefsel.

Ten slotte toonde het transversale beeld van de skeletspieren verlies van kernen die zich anders in de periferie van het endomysium bevonden. Het myofibrilgehalte bleef na de decellularisatie behouden binnen de respectieve fascikels. DNA-kwantificering met behulp van PicoGreen werd ook uitgevoerd, waarbij het DNA-gehalte significant werd verlaagd over de femorale vaten, zenuw, huid, spier en bot.

Volgens dit protocol kan de gedecellulariseerde ledemaat verder worden gekarakteriseerd. Dit omvat het onderzoeken van extracellulaire matrix met behulp van zowel histologische als biochemische methoden, en door vasculaire in te schatten met behulp van beeldvorming. De gedecellulariseerde stam kan ook worden gerecellulariseerd met behulp van weefselspecifieke cellen.