Inkoop en perfusie-decellularisatie van porcine gevasculariseerde flappen in een aangepaste perfusiebioreactor

Deze methode beschrijft de chirurgische verkrijging van drie gevasculariseerde varkensflappen en hun daaropvolgende perfusiedecellularisatie. Deze methode kan helpen bij het regenereren van varkensflappen met behulp van een weefseldecellularisatie- en recellularisatiebenadering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de veelzijdigheid om profusie-decellularisatie te bereiken over een verscheidenheid aan gevasculariseerde varkensflappen in een eenvoudig te monteren bioreactoropstelling.

De hier beschreven techniek kan breed worden toegepast op andere gevasculariseerde flappen als een potentiële tissue engineering-oplossing met behulp van varkensflappen in reconstructieve chirurgie. Maak om te beginnen een in- en uitstroombuis door ongeveer 50 centimeter LS16 platina-gecoate siliconenbuizen te meten. Sluit het ene uiteinde aan op een gele 3-stops pompslang en het andere op een steriele serologische pipet van 2 milliliter om perfusaat van de reinigingsmiddelreservoirs naar de bioreactorkamer te brengen.

Autoclaaf de kamer en slangen in individueel verpakte steriele verpakkingen. Voor het verkrijgen van omentale flap plaatst u een 12 weken oud verdoofd Yorkshire-varken in rugligging en bereidt u de buik vervolgens op de gebruikelijke steriele manier voor. Voer een xipho-navelstreng laparotomie uit om de buik binnen te gaan en het maagcefalad te mobiliseren en het omentum in het operatieveld te plaatsen.

Beginnend bij het linker aspect van de grotere kromming, waar de linker gastro-epiploïsche slagader zich aansluit bij de miltslagader, skeletiseert u de linker gastro-epiploïsche slagader en ader met behulp van een rechte Stevens-tenotomieschaar. Vervolgens ligate en verdeel beide afzonderlijk met behulp van chirurgische banden of clips. Ga langs de grotere kromming van de maag van links naar rechts om de korte vaattakken die voortkomen uit het omentum te ligateeren en te verdelen, waardoor de grotere kromming van de maag ontstaat.

Ga door met de mobilisatie van het grotere omentum totdat de kruising van de rechter gastro-epiploïsche vaten en gastroduodenale slagader wordt aangetroffen. Ligaat vervolgens en verdeel vervolgens de rechter gastro-epiploïsche slagader en ader om de omentale flap te bevrijden en later flapcannulatie mogelijk te maken. Voor tensor fascia lata flap inkoop, plaats het varken in de laterale decubitus positie.

Markeer de binnenste flapgrens van de voorste superieure iliacale wervelkolom, of ASIS, naar de laterale patella en een achterste grens ongeveer 8 tot 10 centimeter caudaal. Gebruik een scalpel om een scherpe incisie te maken aan de distale rand bij de patella. Verdiep de incisie door de onderhuidse weefsels om de fascia boven de rectus femoris te bereiken en ga door met de incisies naar de ASIS langs de gemarkeerde grenzen.

Om alleen de fasciale flap te isoleren, verwijdert u de bovenliggende huidcomponent uit de onderliggende fascialaag. Vervolgens ligate of cauteriseren kleine perforatorvaten naar de huid. Keer terug naar de distale rand van de flap en snijd de diepe fascia in.

Mobiliseer de fascia van de onderliggende vastus lateralis spier naar de ASIS. Nadat u de pedikel naar de diepe femorale vaten hebt gesleept, skeletiseert u de laterale circumflexe femorale slagader en ader die de fasciale flap voeden. Ligate en verdeel vervolgens flapvaten proximaal, waar ze zich aansluiten bij de diepe femorale vaten en latere cannulatie mogelijk maken.

Markeer voor radiale onderarmklepverwerving een vierkant van 3 bij 3 centimeter op het radiale aspect van een verlengde varkensonderarm. Teken een lijn tussen het middelpunt van de proximale flapmarge en de antecubitale fossa om het geschatte verloop van de radiale slagader pedikel aan te geven. Bevestig het arteriële beloop met palpatie.

Snijd vervolgens de huid in met behulp van een scalpel op het distale aspect met een diepte tot aan de antebrachiale fascia. Stompe dissectie met tenotomieschaar totdat de distale radiale slagader en de vena comitantes worden aangetroffen. Vervolgens ligate en verdeel de slagader en aderen met chirurgische banden of clips.

Ga door met de huidincisies op de radiale en ulnaire randen van het gemarkeerde huidplein. Mobiliseer vervolgens de flap van het onderliggende radiale bot met een chirurgisch mes of cautery, gaande van een ulnaire naar radiale richting terwijl de huidflap proximaal naar de antecubitale fossa wordt verhoogd. Gebruik een tenotomieschaar, skelet de radiale slagader en vena comitantes proximaal bij de antecubitale fossa, waar ze respectievelijk de brachiale slagader en aderen verbinden.

Ontleed de vaten van de omliggende fibro-vetweefsels om de vasculaire pedikel te isoleren. Vervolgens ligate en verdeel de slagader en ader afzonderlijk om de radiale onderarmklep vrij te maken. Vervolgens kannuleer de pedikelvaten met 20 tot 24-gauge angiocatheter beveiligd met 3-0 zijden banden.

Spoel heparinized zoutoplossing in de flap arteriële canule totdat een duidelijke veneuze uitstroom wordt waargenomen. Plaats tijdens het werken in een laminaire flow Biosafety-kast flappen in de weefselkamer van de bioreactor. Prime instroombuis met steriele gehepariniseerde zoutoplossing om restlucht te verwijderen en kleppen te plaatsen om verbinding tussen de flap arteriële canule en de mannelijke luerconnector mogelijk te maken.

Gebruik vervolgens steriele hemostaten om de arteriële canule op de connector te schroeven. Spoel vervolgens de gehepariniseerde zoutoplossing door de stopkraan om te controleren of de luerverbinding zonder lekken is en of de flops kunnen worden doordrenkt met bewijs van veneuze uitstroom. Nadat u het deksel van de weefselkamer hebt gesloten, verbindt u de instroombuis met een gele 3-stops pompbuis met de instroomstop van de weefselkamer.

Bevestig ook een inline druksensortransducer aan de instroom 3-weg stopkraan voor perfusiedrukbewaking. Schakel vervolgens de instroom peristaltische pomp in en ga op het beginscherm naar het derde tabblad met behulp van de pijl om de buis-ID in te stellen op 1,85 millimeter. Stel vervolgens de perfusiesnelheid in vanaf het tweede tabblad.

De invoersnelheid als leveringsmethode is ingesteld op 2 milliliter per minuut. Zorg ervoor dat de stroomrichting correct is zoals weergegeven op het scherm. Laad de 3-stops pompslang naar de peristaltische pomp met een compatibele cassette.

Stel de instelling van de uitstroompomp in op een snelheid van 4 milliliter per minuut. Verbind de uitstroombuizen met een gele 3-stops pompbuis met de uitstroomstop van de weefselkamer. Laad vervolgens de 3-stops pompslang naar de peristaltische pomp en start de stroom voor beide pompen door op de aan / uit-knop op elke pomp te drukken.

Begin met de perfusie-decellularisatie van flappen met heparinized zoutoplossing in de weefselkamer gedurende 15 minuten om eventuele achtergebleven bloedstolsels te verwijderen. Vervang na voltooiing de resterende zoutoplossing door 500 milliliter natriumdodecylsulfaat of SDS-decellularisatieoplossing om de flap onder te dompelen. Breng vervolgens de instroomslang over naar de SDS-oplossing en breid het weefsel uit.

Na SDS-decellularisatie aspirateert u het resterende SDS voordat u de klep gedurende één dag met PBS doordrenkt. Na SDS-perfusie-decellularisatie, perquentiële perfusie de flappen in DNA-oplossing gedurende twee uur en vervolgens in PBS gedurende één dag, gevolgd door het overbrengen van de instroombuizen in perazijnzuur en ethanol in gedestilleerd water om de flappen te steriliseren door gedurende drie uur te perfuseren. Als u klaar bent, verwijdert u de flappen aseptisch en dompelt u ze onder in twee wasbeurten van PBS met 1% antibiotica antimycotica gedurende elk 15 minuten.

Bewaar flappen bij 4 graden Celsius totdat ze klaar zijn voor hercellulaireisatie. Gebruik een ponsbiopsietool van 3 tot 10 millimeter om weefselmonsters te verkrijgen voor de evaluatie van gedecellulariseerde flappen. De geïsoleerde gedecellulariseerde flappen die onder handmatige controle werden gespoeld, toonden bewijs van uitstroom uit de vrij drainerende veneuze canule van omentum, tensor fascia lata en radiale onderarmklep.

De grove morfologie van het inheemse omentum, de tensor fascia lata en de radiale onderarmflappen leek onmiddellijk na de verkrijging roze gekleurd. Ter vergelijking: gedecellulariseerde weefsels waren karakteristiek wit of ondoorzichtig van uiterlijk. Histologisch onderzoek van inheemse weefsels met hematoxyline en eosine toonde de aanwezigheid van blauwe kernen aan.

In gedecellulariseerde flappen onthulde histologische kleuring verlies van cellulair materiaal zonder blauwe nucleaire kleuring, wat wijst op een acellulair weefselsteiger. Aanvullende kwantificering van het DNA-gehalte toonde een significante afname van DNA in acellulaire steigers in vergelijking met inheemse weefsels. De belangrijkste overweging is een chirurgische techniek die tijdens de verkrijging wordt gebruikt, waarbij ervoor wordt gezorgd dat schade aan de flap-pedikel wordt voorkomen om daaropvolgende perfusiedecellularisatie mogelijk te maken.

Na perfusie-decellularisatie kunnen de resulterende flappen worden gerecellulariseerd met weefselspecifieke celpopulaties om de inheemse weefselcompartimenten te regenereren.