Toepassing van flowvermimetrie voor kwantificering en analyse van het darmmicrobioom van Caenorhabditis elegans

Het darmmicrobioom speelt een belangrijke rol bij het vormgeven van de fysiologie van de gastheer. Dit protocol maakt met name een hoge doorvoerbeoordeling mogelijk van fluorescerende darmmicrobenkolonisatieniveaus in enkelvoudige, cellulaire dieren op grote schaal. Een groot voordeel van deze methode is de mogelijkheid om het darmmicrobioom van levende dieren in realtime te volgen, waardoor eventuele veranderingen met de fysiologie van de gastheer kunnen worden geïdentificeerd en gecorreleerd.

De procedure wordt gedemonstreerd door Dana Blackburn, een onderzoeksmedewerker van mijn laboratorium. Begin met het wassen van de wormen van het bacteriële gazon met één tot twee milliliter M9-TX. Breng de wormen over naar een gesteriliseerde plaat van twee milliliter met 96 putjes diep.

Pellet ze gedurende één minuut op 300 G en verwijder de vloeistof met behulp van een aanzuigspruitstuk. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet van 1,2 milliliter 1,8 milliliter M9-TX toe aan elk putje van de deepwell-plaat dat is gemengd door een paar keer te pipetteren en centrifugeer gedurende één minuut op 300 G. Breng na de laatste wasbeurt het volume in elk putje op 100 microliter met behulp van het aanzuigspruitstuk.

Voeg 100 microliter 10 millimolaire levamisol en M9-T toe aan elk putje en laat de wormen vijf minuten verlammen. Voeg vervolgens gedurende twee minuten 4% bleekoplossing toe aan elk putje om bacterieklonten te verminderen. Voeg na de bleekbehandeling M9-TX toe aan elk putje van de plaat om de wormen te wassen.

Centrifugeer de plaat en zuig aan tot een eindvolume van 100 microliter na de tweede wasbeurt. Breng de wormen over naar een platte bodem met 96 putjes, die 150 microliter van 10 millimol levamisol en M9-TX bevat. Houd de wormdichtheid op 50 tot 100 wormen per put en splits de wormen in meerdere putten als de populatie te druk is.

Schakel de luchtcompressor, de computer en het LPS-instrument in. Controleer en leeg de afvaltank. Controleer en vul de schede en watertanks bij als het volume laag is.

Zorg ervoor dat de 250 micrometer fluïdische en optische kerneenheid op zijn plaats zit. Sluit de autosampler aan en zet hem aan. Open de autosampler-instrumentsoftware om de autosampler en de LPS-software te openen.

Ga in het LPS-softwarevenster naar bestand en klik op nieuw experiment, selecteer vervolgens opnieuw bestand en klik op nieuwe voorbeeldcontrole. Schakel lasers in om lasers van 488 en 561 nanometer in te schakelen als dit nog niet is gedaan. Maak nu sjablonen voor acquisitiepuntplots, met behulp van vluchttijd, extinctie en fluorescerende kanalen in het LPS-softwarevenster.

Klik met de rechtermuisknop in de hoofdtekst van een grafiek om de schaal te wijzigen. Laad vervolgens de controlemonsters. Selecteer in het autosampler-venster prime, ga naar bestand, klik op script openen om het juiste ingebouwde script te selecteren en klik op OK.

Ga naar het plaatsjabloon in het menu van de samplersoftware om de gewenste putjes voor analyse te selecteren. Nadat u de plaat op de autosampler-fase hebt geladen en vastgezet, drukt u op run-plaat in het autosampler-venster en slaat u het bestand op wanneer daarom wordt gevraagd, klikt u vervolgens op de knop huidige gegevens opslaan op het bovenste lint in het LPS-softwarevenster en slaat u de gegevens opnieuw op. Open de LPS-software.

Navigeer naar bestand en selecteer nieuw experiment, ga vervolgens terug naar bestand en klik op nieuw voorbeeld. Maak een puntplot met de vluchttijd op de X-as en extinctie op de Y-as. Maak nog een stipplot met de vluchttijd op de X-as en rood op de Y-as.

Zorg ervoor dat u de lasers inschakelt om de lasers van 488 en 561 nanometer te activeren. Plaats het controlemonsterbuisje op de monsterpoort en klik vervolgens op verwerven in het dialoogvenster Verkrijgen en doseren. Zorg ervoor dat u het bestand opslaat wanneer daarom wordt gevraagd.

Zodra er voldoende wormen zijn gemeten om populaties te onderscheiden, selecteert u afbreken in de stippengrafiek die de tijd van vlucht versus uitsterven weergeeft. Teken een poort rond het gebied dat de volwassen bevolking vertegenwoordigt. Navigeer vervolgens naar weergave, klik op poorthiërarchie en controleer of de fluorescerende poorten correct worden vermeld onder de poort voor volwassen bevolking.

Maak in de tijd van vlucht versus rode stip poorten rond de gebieden met hoge en lage rode waarden om de interessegebieden te markeren die microbioomkolonisatie bij volwassen wormen laten zien. Zodra de instellingen zijn geoptimaliseerd, gaat u verder met bestand en klikt u op experiment opslaan, klikt u vervolgens op bestand en selecteert u voorbeeld opslaan. Om het opvangapparaat te laden, selecteert u laadplaat A om de verzameltafel in een positie te laten gaan die is voorbereid voor het laden van een opvangbuis of een plaat met 96 putjes.

Voor het doseren naar een plaat met 96 putjes, gaat u naar het installatiegedeelte en selecteert u platen, klikt u vervolgens op gekalibreerde platen en kiest u plaat met 96 putjes. Selecteer vervolgens de putten waarnaar de wormen zullen worden gesorteerd en voer het aantal objecten in dat in elk putje moet worden gesorteerd. Zorg ervoor dat u ook de gated regio's van belang specificeert.

Als er meerdere omheinde gebieden op dezelfde plaat worden gesorteerd, zorg er dan voor dat u het vakje met de poort voor elke put aanvinkt. Klik op OK om de wijzigingen op te slaan. Nadat u de nummers hebt gesorteerd en de locaties hebt toegewezen, laadt u het monster op de monsterpoort en klikt u op de vulplaatknoppen in het dialoogvenster Verkrijgen en doseren om de dosering in een plaat met 96 putjes te starten.

Hogere extensie- en vluchttijdwaarden worden waargenomen bij volwassenen in vergelijking met larven. Nakomelingen van volwassen kinderen van twee dagen oud werden gedomineerd door L1- en L2-stadia, terwijl de meeste nakomelingen van volwassen volwassenen van drie dagen oud L3- en L4-stadia bereikten. Bij kweek op E.coli namen de vluchttijd en extensiewaarden op dag drie toe in vergelijking met dag twee.

Bij kweek op ochrobactrum, BH drie en gemengde culturen vertoonden cenor abdidas allegands verschillen in vluchttijd en extensiewaarden. Verhoogde ochrobactrum BH3-kolonisatie werd waargenomen in de gemengde toestand dan in ochrobactrum BH3 alleen. Daarentegen duidden groene, fluorescerende waarden op een lagere OP50-kolonisatie in gemengde toestand dan in OP50 alleen.

De wormen zijn sterk scheef in de richting van de Y-as, wat suggereert dat de kolonisatie van OP50 bij de meeste wormen laag is, terwijl de kolonisatie van ochrobactrum en BH3 gelijkmatig verdeeld is over de populatie. De relatie tussen ochrobactrum, BH3-kolonisatieniveaus en de ontwikkeling van de gastheer, zoals lichaamsdichtheid en de verschillen in voortplantingspatronen, werd ook waargenomen. De drie dagen oude volwassenen die op het microbioom van de tweekoppige mix groeiden, vertoonden een breed scala aan RFP-intensiteit, wat wijst op individuele variaties in ochrobactrum-kolonisatie binnen de groep.

RFP-beelden van de putten met 15 gesorteerde en individuele wormen van hoge en lage RFP-poorten worden getoond. Het belangrijkste is om te onthouden dat u de juiste bedieningselementen gebruikt voor alle stappen om ervoor te zorgen dat het protocol en de machine goed werken. In realtime kunnen dieren met specifieke kenmerken worden gebruikt om stammen uit gastheer- of microbiële mutantenpools te isoleren om genen te identificeren die post-microbe-interacties reguleren.

Geïsoleerde dieren kunnen ook worden gebruikt voor enkelvoudige of verrijkte fenotypische poolgebaseerde stroomafwaartse analyses, zoals RNA-seq of iets dergelijks. Echt, de mogelijkheden zijn echt eindeloos.